Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli
Summary
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.
Abstract
Hasta kaynaklı iPSC’ler, gelecekteki otolog hücre tedavisi protokolleri için paha biçilmez bir hücre kaynağı olabilir. Perisit türevi mezoangioblastlara benzer iPSC türevi miyojenik kök/progenitör hücreler (iPSC türevi mezoangioblast benzeri kök/progenitör hücreler: IDEM’ler) farklı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan oluşturulan iPSC’lerden kurulabilir. Hastaya özgü IDEM’ler genetik olarak farklı stratejilerle düzeltilebilir(örneğin lentiviral vektörler, insan yapay kromozomları) ve miyojenik farklılaşma potansiyellerinde miyogenez regülatörü MyoD’nin aşırı ifade edilmesi üzerine geliştirilebilir. Bu miyojenik potansiyel daha sonra spesifik farklılaşma tahlilleri ile in vitro olarak değerlendirilir ve immünofolüoresans ile analiz edilir. IDEM’lerin rejeneratif potansiyeli in vivoolarak daha da değerlendirilir Akut ve kronik kas yenilenmesini gösteren iki temsili fare modelinde intramüsküler ve intra-arteriyel transplantasyon üzerine. İDEM’lerin konak iskelet kasına katkısı daha sonra nakledilen farelerde farklı fonksiyonel testlerle doğrulanır. Özellikle, hayvanların motor kapasitesinin iyilaştırılması koşu bandı testleri ile çalışılmaktadır. Hücre engraftasyonu ve farklılaşması daha sonra nakledilen kaslarda bir dizi histolojik ve immünofluoresans tahlilleri ile değerlendirilir. Genel olarak, bu makalede IDEM’lerin farklılaşma kapasitesini değerlendirmek için şu anda kullanılan tahliller ve araçlar açıklanmaktadır, hücre naklinin etkinliğini analiz etmek için transplantasyon yöntemlerine ve sonraki sonuç önlemlerine odaklanmaktadır.
Introduction
Mezoangioblastlar (MAB’ler) perisitlerin bir alt kümesinden elde edilen damarla ilişkili kas progenitörleridir1-3. MAB’lerin uydu hücreleri4 gibi kanonik kas progenitörlerine göre temel avantajı, intra-arteriyel olarak teslim edildiğinde damar duvarını geçme yeteneklerinde bulunur ve bu nedenle hücre tedavisi protokollerinde iskelet kası yenilenmesine katkıda bulunur. Bu özellik kas distrofisinin hem murine hem de köpek modellerinde değerlendirilmiş ve onaylanmıştır1,5,6. Bu preklinik çalışmalar, Duchenne musküler distrofisi olan çocuklarda donör HLA-özdeş MAB’lerin intra-arteriyel nakline dayanan ilk in-man faz I/II klinik çalışmasının temellerini oluşturmuştur (EudraCT no. 2011-000176-33; şu anda İtalya Milano San Raffaele Hastanesi’nde devam etmektedir). Tüm vücudun kasını tedavi etmek için milyarlarca hücreye ihtiyaç duyulan hücre tedavisi yaklaşımlarının ana engellerinden biri, “tıbbi ürünün” (hücreler) sınırlı proliferatif potansiyelidir. Ayrıca son zamanlarda, uzuv-korse kas distrofisi 2D’de (LGMD2D) ortaya çıktığı için bazı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan MAB elde etmenin mümkün olmadığı gösterilmiştir; OMIM #608099)7.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, MAB benzeri kök / progenitör hücreleri insan ve murine iPSC’lerden türetmek için bir protokol yakın zamanda kurulmuştur7. Bu prosedür, yetişkin kas türevi MAB’lere oldukça benzeyen vasküler gen imzası ve immünofenotip ile kolayca genişletilebilir hücre popülasyonları oluşturur. Miyojenik düzenleyici faktör MyoD’nin ifade edilmesi üzerine, hem murin hem de insan IDEM’leri (sırasıyla MİDEM’ler ve HIDEM’ler) terminal iskelet kas farklılaşmasına uğrar. Bu amaca ulaşmak için IDEM’ler, MyoD ekspresyonünü, yaklaşık olarak veya8-10indüklenebilir bir şekilde yönlendirebilen vektörlerle transdüklenebilir. Östrojen reseptörü (MyoD-ER) ile kaynaşmış MyoD cDNA içeren bir lentiviral vektör kullanılır, böylece tamoksifen (östrojen analogu) uygulama11üzerinde nükleer translokasyonuna izin verir. Bu strateji, yüksek verimli7ile hipertrofik çok noktayaükle edilmiş miyotütlerin oluşumuyla sonuçlanır. Özellikle, IDEM’ler nontumorijeniktir, transplantasyon sırasında konak kaslarının içinde yer alabilir ve farklı vektörler(örneğin lentivirüsler veya insan yapay kromozomları) kullanılarak genetik olarak düzeltilebilir ve gelecekteki otolog terapötik stratejilerin önünü açabilir. IDEM’lerin türetmesi, karakterizasyonu ve nakli yukarıdaki yayında açıklanmıştır7. Bu protokol makalesi, IDEM’lerin in vitro miyojenik farklılığını değerlendirmek için yapılan tahlilleri ve daha sonra yapılan sonuç ölçümlerini, kas yenilenmesinin fare modellerinde transplantasyonlarının etkinliğini test etmek için detaylandırmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC’ler, kendi kendini yenileme potansiyellerini korurken süresiz olarak genişletilebilir ve böylece çok çeşitli hücre soylarına farklılaşmaya yönlendirilebilir12. Bu ve diğer nedenlerle iPSC türevi kök/progenitör hücreler otolog gen için umut verici bir kaynak olarak kabul edilir ve hücre tedavisi yaklaşır13. Authors’ın daha önce yayınlanan bir çalışması, perisit türevi MAB’lerin (IDEM’ler)kine benzer bir fenotipe sahip iPSC’lerden fare ve insan miyojenik atalarının n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Giulio Cossu, Martina Ragazzi ve tüm laboratuvara yararlı tartışma ve destek için ve Jeff Chamberlain’e MyoD-ER vektörünü nazik olarak sağladığı için teşekkür ediyor. Canlı hayvanları içeren tüm deneyler, ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kurumlara, yönetmeliklere ve yönergelere uygun ve uygun olarak tamamlanmıştır. Yazarlar laboratuvarındaki çalışmalar İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Topluluğu 7th Framework projeleri Optistem ve Biodesign ve İtalyan Duchenne Ebeveyn Projesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| 4/11/13 | Cappel | 559762 | |
| Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30G needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
