Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Plazma membranı mikro bölgeler lipid ve sterol ortamının fiziksel özelliklerine göre özellikleri ve süreçleri sinyalizasyon özellikle rollere sahiptir. Proteomik analiz için bitki hücrelerinden sterol bakımından zenginleştirilmiş membran mikro bölgelerini ayıklama çok hazırlık adımları ve diğer hücre bölmelerinden kontaminasyonların kaynaklarına esas olarak zor bir iştir. Plazma membranı, bir bitki hücresinde, tüm membran sadece yaklaşık% 5-20 teşkil eder ve bu nedenle, yüksek düzeyde saflaştırılmış plazma membran fraksiyonunun izolasyonu zordur. Sık kullanılan bir yöntem, 95% 1 bir saflığı olan plazma zar vezikülleri verir polietilen glikol ve dekstran, sulu iki aşamalı bölümleme içerir. Plazma membranı içinde Sterol zengin zar mikro bölgeler alkalik pH seviyelerinde de soğuk bir noniyonik deterjan ile muamele üzerine çözünmezler. Bu deterjan, dirençli membran fraksiyonu olarak ultra-santrifüj ile hacmi, plazma membran ayrılabilirucrose degrade 2. Daha sonra, proteinler, metanol / kloroform çökeltme sükroz gradyanı düşük yoğunluklu bant elde edilebilir. Çıkarılan protein daha sonra, sindirilmiş tuzu alınır ve son olarak LC-MS/MS ile analiz tripsin edilecektir. Sterol zengin mikro bölgeleri için bizim çıkarma protokolü Arabidopsis thaliana hücre kültürlerinden temiz deterjan dirençli membran fraksiyonlarının hazırlanması için optimize edilmiştir.
Biz faiz 3 biyolojik tedavisi sonrasında nicel karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için sadece azot kaynağı olarak K 15 NO 3 ile Arabidopsis thaliana süspansiyon hücre kültürlerinin tam metabolik etiketleme kullanın. Ortak protein çıkarımı için, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre kültürlerinin eşit oranlarını karıştırılarak son sayısal sonuç üzerinde hazırlık aşamalarının etkileri minimumda tutulur. Ayrıca, ekstraksiyon sırasında malzeme kaybı kontrolü ve aynı şekilde muamele örnekleri, her ikisi de bir etkileyecekd Bu nedenle ışık ve kaldırma peptidin oranı sabit kalır. Önerilen yöntemde etiketli veya diğer denetim 4 olarak görev yaparken etiketsiz hücre kültürü, bir biyolojik tedavi uğrar ya.
Giriş
1972 yılında, Jonathan Singer ve Garth Nicolson genellikle 1960'ların başında kabul edilen protein-lipid-protein sandviç modeli yerine, akışkan mozaik modeli hücre zarının bir yapı modelini önerdi. Singer ve Nicolson biyolojik zar tüm lipid ve protein molekülleri serbestçe ve kolayca 5 yaygın iki boyutlu bir sıvı olarak kabul edilebilir olduğu varsayılmaktadır. O zamandan bu yana, zar bileşimin plazma zarı ve bilginin bir yapı modeli daha da karmaşık bir hale geldi. Özel olarak, plazma membranı içinde, bu protein kompleksleri ve lipid / sterol göre yapısal bozukluğu olan yapıların mikro bölgeleri olarak görülebilir. Yapay modeli membranlar 6,7,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
PROSEDÜRÜ
Ekstraksiyon protokolü yaygın olarak kullanılan reaktifler ve tamponlar:
- Arabidopsis thaliana hücre süspansiyon kültürleri için JPL orta
- 3 uM H 3 BO 3
- 3 mcM MnSO 4 x H 2 O
- 1,1 uM ZnSO 4 x 7H 2 O
- 0.15 uM KJ
- 0.03uM Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
- 3 nM CoCl2 x 6 H2O
- 3 nM CuSO 4 x 5H 2 O
- 0.9 mM CaCI2 x 2 H 2 O
- 0.5 mM MgSO 4 x 7H 2 O
- 0.5 uM FeSO....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Metabolik olarak etiketlenmiş Arabidopsis hücre kültürleri kullanılarak sunulmuştur protokolü ile bitki dokusunun (Adım 2, Şekil 2 ve 4) plazma membranları izole ve plazma zarı içindeki deterjan dayanıklı zar fraksiyonları ettirecek mümkündür (aşama 3, Şekil 3 ve 5). Daha sonra, protokol izin verir, bu deterjan dirençli membran fraksiyonları (aşama 4) ve karşılaştırmalı proteomik analizi (aşama 5) için, proteinin sindirim proteinlerin elde edilmesi. Son olarak, Phosphopeptides .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada sunulan protokolün birçok adımları içerir ve hepsi deterjan dayanıklı membranlar ve deterjan çözünebilen fraksiyonlara bitki plazma zarı saf ve temsilci damıtılmalarının elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle, talimat olarak her adımı takip etmek önemlidir.
Iyonik olmayan deterjanın (aşama 3.2) ile birlikte, plazma membran fraksiyonunun tedavisi membran mikro bölge fraksiyonasyon kalitesi üzerinde güçlü bir etkisi vardır. Farklı preparatlar arasında yeniden üretilebilir sonuç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Yazar, Witold Szymanski, Moleküler Bitki Fizyolojisi Max Planck Enstitüsü'nün bir çalışanıdır. Yazar, Waltraud Schulze Hohenheim Üniversitesi, Almanya'da bir çalışanıdır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Kimyasallar, aksi | |||
| Amonyak (stokta %25 çözelti) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μ m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polietilen glikol< / em> (PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dekstran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Tripsin | Promega | V5113 | |
| Proteaz inhibitör kokteyli (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge İzotop Laboratuvarları | NLM-765-PK | |
| EKİPMAN | |||
| Optima L-80 XP Ultrasantrifüj | Beckman | ||
| Plaka okuyucu | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Sıvı Kromatografı | Termo Bilimsel | ||
| LTQ-Orbitrap kütle spektrometresi | Thermo Scientific | ||
| Santrifüj 5810R | Eppendorf | ||
| Santrifüj 5417R | Eppendorf | ||
| Termomikser | Eppendorf | ||
| Hız Vac RVC 2-25 | Mesih | ||
| Çalkalayıcı Unimax 2010 | Heidolph |
Kaynaklar
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
