Force mätningar kan användas för att påvisa förändringar i muskelfunktion grund för utveckling, skada, sjukdom, behandling eller kemisk toxicitet. I denna video visar vi en metod för att mäta kraft under en maximal kontraktion av zebrafisk larver bålen muskeln.
Zebrafisk larver ger modeller av muskel utveckling, muskelsjukdom och muskel-relaterad kemisk toxicitet, men liknande studier ofta saknar funktionella åtgärder för muskel hälsa. I denna video artikeln visar vi en metod för att mäta kraft generation under kontraktion av zebrafisk larver bålen muskeln. Force mätningar åstadkommes genom att placera en sövd larv in i en kammare fylld med en saltlösning. Den främre änden av larven är bunden till en kraftomvandlare och den bakre änden av larven är knutet till en längd controller. En isometrisk rycka kontraktion framkallas av elektriska fältet stimulering och kraften svaret registreras för analys. Force generation under kontraktion ger ett mått på total muskel hälsa och specifikt ger ett mått på muskelfunktion. Även om vi beskriva denna teknik för användning med vildtyp larver, kan denna metod användas med genetiskt modifierat larverna eller med larver behandlas med läkemedel eller gifter,att karaktärisera modeller muskelsjukdom och utvärdera behandlingar, eller att studera muskel utveckling, skada, eller kemisk toxicitet.
Young zebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dagar efter befruktning (DPF), erkänns alltmer som en användbar organism för skelettmuskulaturen forskning. Unga larver används för att modellera människans muskelsjukdom 1-9, utvärdera läkemedel och terapeutiska strategier 10-11, studera muskelskada 12, förstår muskelutveckling 13-16, och undersöka muskel-relaterad kemisk toxicitet 17-19. Typiska studier i dessa områden att undersöka i vilken grad friska muskler görs onormal genom genetisk manipulation eller exponering för toxiska ämnen, och vissa studier undersöker i vilken grad onormal muskel svarar på behandlingen. Kritisk till framgång för dessa studier är förmågan att korrekt bedöma muskel hälsa.
Medan det finns en mängd olika metoder som finns för att bedöma muskel hälsa i zebrafisk larver, få ge direkt information om muskelfunktion. Muscle hälsa brukar utvärderas av appearance, som bedömt av histologisk färgning 6,8,11, immunfärgning 9,15,16,18, ljusmikroskop 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16 eller dubbelbrytning 7,9,11, men dessa tekniker ger morfologisk information. Trunk och förskjutningar svans och simning hastighet 4,17 utvärderar motoriken, men dessa är inte direkta åtgärder av muskelfunktion eftersom de också avspeglar neural input, energiomsättning, och andra processer.
Däremot mäter kraft generation under kontraktion ger en direkt bedömning av muskelfunktion och utgör ett mått på total muskel hälsa. Ytterligare fördelar med detta tillvägagångssätt är enkla dataanalys och kvantitativa resultat. I denna video artikeln ger vi ett detaljerat förfarande för mätning av kraft generering av larver muskler, i hopp om att fler forskare kommer att använda denna metod för att komplettera befintliga åtgärder för muskel hälsa i sin forskning.
<pclass = "jove_content"> Det övergripande målet med denna metod är att mäta kraft generation under kontraktion av zebrafisk larver bålen muskeln. För att uppnå detta mål, är en zebrafisk larv bedövades och placerades i en kammare fylld med en saltlösning. Den främre änden av larven är bunden till en kraftomvandlare och den bakre änden av larven är knutet till en längd controller. Muskel aktivering åstadkommes genom elektriskt fält stimulering, och att stimuleringsströmmen och längden av larven justeras för att producera maximal rycka kraft. En isometrisk rycka kontraktion framkallas och kraften svaret registreras för analys.För att vara tydlig, mäter denna teknik inte krafter som genereras av larver musklerna under simning. Eftersom båda ändarna av larven är bundna till utrustning och eftersom larven förblir sövda, kan det inte initiera rörelse under testningen. Vidare aktiverar fältstimulering alla muskelfibrer samtidigt att inducera en miljarderateral kontraktion, vilket inte är vad naturligt förekommer 20. Därför, snarare än att mäta de faktiska krafter som alstras under simning, bestämmer denna teknik förmågan kraftgenererande av de larver muskler.
Vi har använt denna teknik för att demonstrera muskelsvaghet i en zebrafisk modell av nemaline myopati 21, såväl som för att utvärdera effekten av antioxidantbehandling på muskelfunktion i en zebrafisk modell av multi-MiniCore sjukdom 22. Andra har använt en liknande teknik 23 för att undersöka effekterna av en miljöförorening på muskelfunktion 19.
Denna metod mäter kraft generation under en ryckning att bedöma muskelfunktion i bålmusklerna av zebrafisk larver. Även tetanic sammandragningar kan framkallas i zebrafisk larver (t.ex. genom 200 stimuleringspulser / sek under en period av 0,2 sek), är den maximala tetanic kraft endast 10-15% större än den maximala rycka kraft. Därför är den kraft som genereras under en ryckning ett rimligt mått av kraftgenererande kapacitet. Ryckningar är att föredra framför tetanic sammandragningar eftersom ryckningar är mindre benägna att orsaka rippning eller halka på suturen banden.
För att generera meningsfulla data med denna teknik, bör maximal rycka kraft uppnås för varje larv och variationen mellan experimentella grupper bör minimeras. Med dessa mål i åtanke, erbjuder vi följande förslag. Först, ta hand när kopplingsförbehållet larven till kraftgivare och längden rören controller. Om sutur slingor dras åt alltförmycket, kommer suturen skär genom muskelvävnad. Om suturen slingorna inte dras åt tillräckligt, kommer den kraft som genereras av larven inte helt överföras till kraftomvandlare. Båda situationerna, men i synnerhet det sistnämnda, underskatta maximal rycka kraft. Andra kan sedan testa flera experimentella grupper ta flera timmar (20-30 min / larv), växlar mellan grupper eftersom larverna kommer att fortsätta att utvecklas under testperioden.
Medan vissa av de nämnda utrustning är avgörande för mätning av maximal rycka kraft (t.ex. kraftgivare, aktuell stimulator), andra objekt är inte absolut nödvändigt. Videon sarcomeren längd systemet är önskvärt men inget krav. Som ett alternativ, kan en serie av ryckningar användas för att hitta optimal längd, under vilken längden av larven justeras tills maximal rycka kraft uppnås. En temperatur styrsystem är inte heller absolut nödvändigt. Temperaturreglering är kritisk när MEASuring twitch kinetik, som är mycket känsliga för temperatur, medan maximal twitch kraft inte är särskilt känslig för små förändringar i temperatur och kunde mätas vid rumstemperatur. Notera att oberoende av temperaturen i kammaren under force testning, bör larverna hållas vid optimal tillväxt temperatur på 28,5 ° C 24 före tvinga testning för exakt stadieindelning.
Larverna testas i en Tyrodes lösning innehållande tricaine. Vi använder 0,02% (vikt / volym) tricaine, den koncentration som rekommenderas för anestesi 24, för att eliminera spontana kontraktioner framkallade av nervsystemet och sålunda förhindra trötthet under kraft testning. Tricaine underlättar också tie-på steg och minskar den totala testtiden. Dock kan vi konstatera att även tricaine i test lösningen konsekvent minskar den maximala rycka kraft med cirka 30%. En liknande effekt har också observerats i grodyngel svans muskel, där tricaiNE reducerad kraft generationen efter neuromuskulär transmission blockerades, vilket tyder på att tricaine har en direkt effekt på muskeln 25. Tricaine kan minska retbarhet muskelcell genom att minska natrium konduktans över cellmembranet, som den gör i nervceller 26. Andra alternativ för att blockera aktivering av motoneuroner är d-tubokurarin och α-bungarotoxin men till skillnad tricaine är dessa föreningar inte hud-genomsläpplig och måste injiceras direkt in i huvudet, ryggmärg, eller hjärta 27. Enskilda utredare kommer att behöva bedöma huruvida tricaine är önskvärd för sin specifika applikation. Om tricaine ingår i testningen lösningen bör koncentrationen vara konsekvent mellan experiment och forskare bör kontrollera att effekten av tricaine inte varierar mellan experimentella grupper.
Vi beskriver denna metod för larver så unga som 3 DPF och lika gammal som 7 DPF. Även muskelfibrer verkar vara functional så tidigt som 17 timmar efter befruktningen, när spontana svans rörelser börjar 27, den korta längden på svansen före 3 DPF hindrar knyta larven till testutrustning. Vi brukar testa inte larv efter 7 DPF eftersom många sjukdomstillstånd modeller inte överlever mycket längre än denna tid. Om testning larver bortom 5 DPF, bör larverna matas. Vi har observerat att unfed larver har mindre muskler och generera mindre maximal rycka kraft än Fed larver, sannolikt på grund av den minskande gulesäcken. Således kan det vara önskvärt att testa larver mellan 3-5 DPF, för att undvika ytterligare rörlig av extern matning.
Sammanfattningsvis beskriver vi en kvantitativ och tillförlitlig metod för att mäta kraft generering under en maximal ryckning sammandragning av zebrafisk larver bålen muskeln. Denna metod kan användas för att bedöma den allmänna hälsan hos zebrafisk larver muskler och specifikt ger information om muskelfunktion. Förutom att ge information omstorleken av kraft generation, kan denna teknik användas för att studera kinetiken av force generation eller anpassas för att studera muskeltrötthet 22. Även om vi beskriver denna teknik för användning med vildtyp larver, kan denna metod användas för att genetiskt modifierade larver eller larver behandlas med läkemedel eller gifter, för att karakterisera modeller muskelsjukdom och utvärdera behandlingar, eller att studera muskel utveckling, muskel skada, eller muskel-relaterad kemisk toxicitet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Angela Busta för hjälp med zebrafisk djurhållning. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (AG-020.591 till SVB och 1K08AR054835 till JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |