Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Sommario

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in un In vivo Contesto. Immunofluorescenza per visualizzare con precisione il plesso vascolare è fondamentale per il successo di questo tipo di studi.

Abstract

L'angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l'angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.

Introduzione

L'angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una 'punta' cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali 'gambo'. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una region....

Protocollo

Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.

1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi

1. Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici.
2. Utilizzare forbici e pinze per enucleare l'occhio.
3. Luogo forbici sotto l'occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l'occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente 4% paraformaldeide (PFA) composto 2x in PBS a temperatura ambiente.
4. Consentire ad ogni occhio di fissare per il 10 - 15 min, poi trasfe....

Risultati

Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d'insieme dell'organizzazione vascolare della retina. Inoltr.......

Discussione

Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l'occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MaterialPipette
in plastica Forniture	laboratorio scientifico	PIP4210	Rimuovere la punta con le forbici per creare un foro largo
Piastre BD Falcon a 24 pozzetti	Forniture per laboratorio scientifico	353226
Piastre Petri selezionate TV Forniture per laboratorio scientifico da 90 mm		SLS2002
vetrini Histobond	VWR	631-0624
Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pinzette #5	World precision instruments	14095
Forbici a molla lunghe 10,5 cm, con lame diritte da 8 mm	precision	instruments 501235	Utilizzate per l'enucleazione
Forbici Vannas lunghe 8,5 cm, con lame diritte da 7 mm e punte superfini da 0,025 x 0,015 mm	Strumenti di precisione mondiali	500086	Utilizzato per la dissezione della retina
Forbici vannas superfini lunghe 8 cm con lame diritte da 3 mm e punte superfini da 0,015 x 0,015 mm Strumenti di	precisione mondiali	501778	Utilizzato per la dissezione
provette cristalline per retina 2 ml	Starlab	E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasico	Sigma	S0876	Reagente PBS
Fosfato di potassio monobasico	Sigma	P5655	Reagente PBS
Cloruro di sodio	Sigma	S9625	Reagente PBS
Paraformaldeide	Sigma	P6148	Truccare in 2x PBS e conservare a -20 ° C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Siero d'asino	Sigma	D9663
Siero di capra	Vector	S-1000
Reagente anti-sbiadimento Prolong Gold	Invitrogen	P36930	Reagente di montaggio
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Utilizzare a Diluizione 1:200
Isolectina GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Utilizzare a diluizione 1:200
Anticorpi primariAnti-NG2 (policlonale di coniglio)Millipore AB5320 Rileva i periciti Anti-GFAP (clone GA5, monoclonale di topo)Millipore MAB360 Rileva gli astrociti Anti-Desmin (clone Y66,
coniglio monoclonale)	Millipore	04-585	Rileva i periciti
Anti-Collagene IV (coniglio policlonale)	Chemicon	AB756P	Rileva la membrana basale vascolare
Anti-alfa muscolo liscio actin-Cy3 (clone 1A4, topo monoclonale)	Sigma	C6198	Rileva le cellule muscolari lisce vascolari.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	550546	Rileva le cellule endoteliali
Anti-CD31 (clone MEC13.3, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	553370	Rileva le cellule endoteliali
Anti-VE-Caderrina (clone 11D4.1, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	550548	Rileva le giunzioni delle cellule endoteliali
Anti-Alk1 (capra policlonale)	R& D Systems	AF770	Rileva le cellule
Anticorpi secondari
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-ratto-Alexa488	Invitrogen	A11006	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-ratto-Alexa594	Invitrogen	A11007	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-topo-Alexa488	Invitrogen	A11029	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Asino anti-capra-Alexa594	Invitrogen	A11058	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Microscopi
Microscopio da dissezione	Zeiss	Stemi SV6
Fotocamera	Zeiss	Axiocam HRc	Fotocamera per microscopio da dissezione
Microscopio epifluorescente	Zeiss	Axioimager con fotocamera Apotome
	Fotocamera Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

per World di endoteliali per microscopio confocale