La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Resumen

La actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 en células de cáncer sometidos a la mitosis se documentó en tiempo real por imagen confocal en vivo. 34 PJ-erradicar el cáncer de mama humano MDA-MB-231 células que albergan actividades extra-centrosomas en la mitosis. A diferencia de la mitosis bi-focal normal, las actividades extra-centrosomas no se agruparon en los dos polos del huso en la presencia de PJ-34.

Resumen

Derivados de fenantreno que actúan como potentes inhibidores PARP1 impidió la agrupación bi-focal de centrosomas supernumerarios en células humanas de cáncer de varios centrosomales en mitosis. El fenantridina PJ-34 era la molécula más potente. Desagrupación de actividades extra-centrosomas causa insuficiencia mitótico y la muerte celular en células multi-centrosomales. Cánceres humanos más sólidos tienen alta incidencia de extra-centrosomas. La actividad de PJ-34 se documentó en tiempo real, mediante formación de imágenes confocal de cáncer de mama humano en vivo las células MDA-MB-231 transfectadas con vectores que codifican para fluorescente γ-tubulina, que es muy abundante en los centrosomas y para fluorescente presente en la histona H2B los cromosomas. Arreglos de cromosomas aberrantes y de focos agrupados-γ-tubulina que representan centrosomas declustered se detectaron en las células transfectadas MDA-MB-231 después del tratamiento con PJ-34. Un-agrupados adicional-centrosomas en los dos polos del huso precedieron la muerte celular. Estos resultados vinculados FOr la primera vez que la actividad citotóxica exclusiva recientemente detectado de PJ-34 en células de cáncer humano con centrosomas adicional-de-la agrupación en la mitosis, y el fracaso mitótico que conduce a la muerte celular. De acuerdo con los resultados anteriores observados por microscopía confocal de células fijas, PJ-34 células de cáncer erradicado exclusivamente con múltiples centrosomas sin afectar las células normales en mitosis con dos centrosomas y cabezales bi-focal. Esta actividad citotóxica de PJ-34 no fue compartida por otros inhibidores potentes PARP1, y se observó en PARP1 deficientes extracentrosomes albergan MEF, lo que sugiere su independencia de la inhibición de PARP1. Vivir imagen confocal ofrecen una herramienta útil para la identificación de nuevas moléculas erradicar las células durante la mitosis.

Introducción

Fenantreno deriva inhibidores PARP1, incluyendo PJ-34, fueron diseñados para proteger a las células en reposo de la muerte celular apoptótica inducida por la energía que consume PARP1 mediada por reparación del ADN en condiciones de estrés (accidente cerebrovascular o infarto de miocardio) ^1. Sin embargo, recientemente hemos descubierto que PJ-34, a dos veces mayor que la concentración que induce la inhibición PARP1, puede causar exclusivamente la muerte celular en células humanas de cáncer ^2,3. Cuanto más rápida sea la proliferación de la célula era, más eficiente será la erradicación de las células era. La actividad citotóxica de PJ-34 se atri....

Protocolo

1. Cultivo de células Preparación

Células MDA-MB-231 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection) y se almacenan en nitrógeno líquido.

1. Seed 10 ⁶ MDA-MB-231 células en 92 mm de diámetro en una placa de Petri 10 ml de medio completo que contenía medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM), 10% de suero de caballo, 1% de L-glutamina, y 1% Penstrep-anfotericina B. Permiten a las células a proliferar a aproximadamente 80-100% de confluencia.
2. Retire el medio de cultivo de plato y desechar.
3. Se lava la capa de células brevemente con 0,25% (w / v) de solución de tripsina-EDTA para eliminar....

Resultados

PJ-34 es un soluble en agua estable fenantridina ¹ (Figura 1). Nuestros resultados anteriores revelaron la muerte celular y extra-centrosomas de-agrupados en varios tipos de células de cáncer de múltiples centrosomales fijos que fueron tratados con PJ-34. En contraste, las células normales en proliferación no fueron perjudicados ^2,3. Centrosomas se identificaron mediante doble marcaje con anticuerpos dirigidos contra centrine1 y γ-tubulina en las células extra-centrosomales fijos <.......

Discusión

Vivo imagen confocal proporciona una documentación en tiempo real del efecto citotóxico de PJ-34 en las células de múltiples centrosomales en vivo durante la mitosis (Figura 3 y la información complementaria). Esta fue la primera documentación vivo atribuir la citotoxicidad de PJ-34 en células de cáncer humano a centrosomas adicionales de-agrupación y la muerte celular, lo que sugiere la inducción de la muerte celular mitótica catástrofe por PJ-34 ^5-9. En contraste, se observó la agrupación b.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVOS
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965
FBS (Suero fetal bovino)	Invitrogen (GIBCO)	12657
Solución Pen-Strep-Ampho	Biological Industries, Israel	03-033-1B
L-glutamina	Invitrogen (GIBCO)	25030-024
0.25% Tripsin-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200
Placas de Petri de 92 mm	Nunc,Thermo scientific	150350
Placas de cultivo con fondo de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de 35 mm	MatTek Corporation, EE. UU	P35GC-0-14-C
Kit de ensayo de detección de ATP luminiscente	Abcam	ab113849
NDS (Suero de burro normal)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Anticuerpo anti-&alfa;-tubulina	Sigma	T9026	dilución 1:250 (IF)
Anticuerpo anti-γ-tubulina	Sigma	T5192	dilución 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG	Invitrogen	A-11017	dilución 1:1.000 (IF)
Alexa Fluor 568 Burro Anti-Conejo IgG	Invitrogen	A-10042	dilución 1:1.000 (IF)
Reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI (montaje)	Invitrogen	P36935
JetPEI (reactivo de transfección liposomal)	Polyplus	101-10
EQUIPMENT
Microscopio confocal	Leica (Mannheim, Alemania)	TCS SP5II

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