في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا عزل السكان من الخلايا الجذعية البالغة، ووصف الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية أو ASCS، من الأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة عزلة ASCS من lipoaspirates باستخدام دليل، بروتوكول الهضم الأنزيمية باستخدام كولاجيناز.
في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، وعزل السكان جديدة من الخلايا الجذعية البالغة من liposuctioned الأنسجة الدهنية التي أسموه في البداية خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. منذ ذلك الحين، تم إعادة تسمية هذه الخلايا الجذعية الخلايا الجذعية الدهنية كما مشتقة أو ASCS وذهبت لتصبح واحدة من خلايا جذعية للبالغين الأكثر شعبية للسكان في مجالات أبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي. وصف الآلاف من المقالات الآن استخدام ASCS في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجدد، بما في ذلك تجديد العظام، وإصلاح الأعصاب الطرفية والهندسة القلب والأوعية الدموية. وقد بدأت المقالات الأخيرة لوصف عدد لا يحصى من الاستخدامات لASCS في العيادة. ويحدد البروتوكول هو موضح في هذه المقالة الإجراء الأساسي لليدويا وإنزيمي عزل ASCS من كميات كبيرة من lipoaspirates تم الحصول عليها من الإجراءات التجميلية. يمكن بسهولة أن تحجيم هذا البروتوكول أعلى أو لأسفل لaccommodأكلت حجم lipoaspirate ويمكن تكييفها لعزل ASCS من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من خلال abdominoplasties وإجراءات أخرى مماثلة.
في عام 2001، وقد وصفت مجموعة من السكان المفترضة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من الأنسجة الدهنية في مجلة هندسة الأنسجة 1. أعطيت هذه الخلايا اسم معالجتها Lipoaspirate أو جيش التحرير الشعبى الصينى الخلايا بسبب اشتقاقها من الأنسجة المصنعة lipoaspirate الحصول عليها من خلال الجراحة التجميلية. واستند أسلوب العزل الموضحة في هذه المقالة على الاستراتيجيات القائمة الأنزيمية للعزلة من انسجة الوعائية الكسر (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية 2. تم تعريف صندوق التبرعات الخاص باعتباره الحد الأدنى من السكان معالجة خلايا الدم الحمراء، والخلايا الليفية، الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء، pericytes وقبل الخلايا الشحمية التي لم تنضم إلى ثقافة الركيزة الأنسجة 2، 3. ويقترح زراعة هذا SVF مع مرور الوقت للقضاء على العديد من هؤلاء السكان الخلية تلويث ويؤدي إلى ملتصقة والسكان ليفية. وقد تم تحديد هذه الخلايا الليفية في الأدب على مدى السنوات ال 40 الماضية بأنها مرحلة ما قبلالخلايا الشحمية. ومع ذلك، أظهر فريق بحثنا أن هذه الخلايا تمتلك أرومية متوسطة multipotency وإعادة تسمية السكان SVF ملتصقة باسم خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. وأضافت دراسات لاحقة من قبل العديد من المجموعات البحثية الأخرى لهذه الإمكانات، مما يشير إلى كل من الأديم الباطن وإمكانات الأدمة (للمراجعة انظر 4). منذ ذلك الوقت، ظهرت العديد من الشروط الإضافية لهذه الخلايا في الأدب. من أجل توفير نوع من التوافق في الآراء، اعتمد مصطلح الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة أو ASCS في المؤتمر الثاني IFATS السنوية 2. على هذا النحو، سيتم استخدام ASC المدى في هذه المقالة.
بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة هو إجراء بسيط نسبيا والتي تتطلب معدات المختبرات القياسية ويستخدم الكواشف بسيطة مثل الفوسفات مخزنة المالحة والكواشف وسائل الاعلام زراعة الأنسجة القياسية وكولاجيناز. ويمكن ان تنتج أعداد كبيرة من ASCS اعتمادا على كمية من النسيج الدهني بدءا حجم وج اللاحقةالوقت ulture. ومع ذلك، فإن معالجة مثل هذا المبلغ الكبير من الأنسجة الدهنية يمكن أن تقدم بعض القضايا المادية التي يمكن تخفيفها إلى درجة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول لا تتطلب مرافق زراعة الأنسجة عقيمة واغطية وافق السلامة الأحيائية، مما يجعل من الضروري استخدام مرفق زراعة الأنسجة المعتمدة. يمكن هذا الشرط أيضا خفض فائدة السكان ASC في التطبيقات السريرية ما لم يتم عزل كانوا في الممارسات التصنيعية الجيدة مرافق (GMP) وافق المصممة لعزل وتوسيع المواد للاستخدام السريري. كبديل، فإن النظم الآلية التي يمكن عزل ASCS في نظام مغلق في غرفة العمليات تجنب هذه المسألة الأساسية والسماح للاستخدام الفوري من ASCS دون أي حاجة لاحقة التوسع في المختبر. حتى الآن، هناك ستة النظم الآلية المتوفرة تجاريا لعزل الخلايا من الأنسجة البشرية. هذه الأنظمة قد تجعل من الممكن عزلعدد كبير من ASCS من كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية التالية الحصاد على الفور. ويمكن عندئذ أن يعيد هذه ASCS في جسم المريض لمجموعة متنوعة من الأغراض دون التجدد المريض الاضطرار إلى مغادرة غرفة العمليات. بالإضافة إلى هذا البروتوكول يصف العزلة دليل ASCS، وتعطى بروتوكول لعزل الآلي ASCS باستخدام نظام Celution أيضا في مقال مصاحب.
الأنسجة الدهنية لعزل ASCS يمكن أن يأتي في أشكال كثيرة: من قطعة صلبة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من خلال استئصال أو رأب الشحم إلى قطع أصغر الحصول عليها عن طريق إما استخراج حقنة أو بمساعدة شفط رأب الشحم (أي شفط الدهون). ما إذا كان المزيد من الخلايا صندوق التبرعات ا?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أود أن تقر وأشكر هؤلاء الأفراد البحوث الإضافية التي ساهمت في تطوير بروتوكول صفها وعزلتها من ASCS، بما في ذلك: الدكتور H. بيتر لورنز، دكتوراه في الطب، الدكتور هيروشي Muzuno، دكتوراه في الطب، الدكتور جيري هوانغ، MD الدكتور آدم كاتز، دكتوراه في الطب، والدكتور وليام Futrell، دكتوراه في الطب، الدكتور رونغ تشانغ، DDS، دكتوراه، والدكتور لاريسا رودريجيز، دكتوراه في الطب، الدكتور زيني ألفونسو، دكتوراه، والدكتور جون فريزر، دكتوراه. وقد مولت النتائج المقدمة، في جزء منه، من خلال المنح البحثية المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، بما في ذلك NIAMS ومعاهد NIDCR.
Reagent | |||
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
indomethacin | Sigma | I-7378 | |
apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
[header] | |||
Equipment Needed | |||
Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |