말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식
Summary
후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 이 특정 속성은 세포 이식에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에서 후두 신경 손상 모델에서 OECs의 사용을 기반 셀룰러 이식 모델을 제시한다.
Abstract
후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장과 재성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 사실, 기본 후각 시스템은 심지어 성인 동물에서 새로운 신경 세포에 상승을 제공 할 수있는 기능이 특징입니다. 이 특별한 기능은 신경의 유리한 미세 환경을 만들 OECs의 존재에 부분적으로 기인한다. OECs이 속성은 척수 손상 모델에서와 같이 세포의 이식에 사용되었습니다. 말초 신경계는 중추 신경계 이상의 신경 손상 후 재생하는 더 큰 용량을 가지고 있지만, 완전한 섹션은 후두 신경 절개의 얼굴 후 특히 축삭 재성장 동안 misrouting을 유도한다. 특히, 재발 후두 신경 (RLN)의 전체 단면은 성대의 synkinesis의 결과로 탈선 축삭 재성장을 유도한다. 이 특정 모델에서, 우리는 OECs 이식을 효율적으로 축삭의 재성장을 증가 시킨다는 것을 보여 주었다.
ve_content "> OECs가 후각 점막 (OM-OECs) 및 후각 전구 (OB-OECs) 모두에 존재하는 여러 소집단으로 구성되어있다. 우리는 여기에서 OECs의 서로 다른 모집단의 사용을 기반으로 세포 이식의 모델을 제시 RLN 부상 모델.이 패러다임을 사용하여이, OB-OECs과 OM-OECs의 차 문화가 RLN의 부와 문합 후 리겔에 이식했다. 두 달 수술 후, 우리는 videolaryngoscopy에 따라 상호 보완적인 분석에 의해 이식 된 동물을 평가, 근전도 (EMG) , 조직 학적 연구. 첫째, videolaryngoscopy 특히 근육 cocontractions 현상이. 그런 다음, EMG 입증 풍요 로움과 근육 활동의 동기를 분석한다. 마지막으로, 톨루이딘 블루 염색에 따라 조직 학적 연구는 번호와 프로파일의 정량화를 허용, 우리는 후두의 기능을 평가할 수 유수의 섬유.모두 함께, 우리는, 문화, IDE에게 분리하는 방법을 여기에 설명OM와 OB에서 ntify 이식 OECs RLN 섹션 – 문합 방법 축삭 재성장 및 후두 기능에 대한 이러한 이식 세포의 효율성을 평가하고 분석하는 후.
Introduction
후각 점막 (OM) 중추 신경계 및 말초 신경계 후각 망울 (OB)에서, 일차 후각 시스템은 별개의 두 부분으로 구성된다. 주요 후각 시스템은 포유류 종의 삶을 통해 자기 갱신에 대한 기본 후각 뉴런 (PON)의 용량을 특징으로한다. 이러한 능력으로 인해 OM의 신경 줄기 세포의 존재를 가능하게한다. OM에서 OB에 PON의 성장과 재성장은 후각 ensheathing 세포라는 전문 glial 세포 (OECs)에 의해 촉진된다. OECs 1 OB하는 OM에서 PON의 신경에 유리한 미세 환경을 만드는 신경 능선 세포입니다. 이것에 의해, OECs 세포 2,3의 다른 모집단을 구성하는 OM와 OB에서 찾을 수 있습니다. OECs의 다른 특성은 여러 가지 신경계 병변 패러다임 4 세포 이식을 위해 그들을 사용하는 리드 과학자가있다. 사실, OECs 생산 성장 요인, 홍보, 아교 퇴치 용을 감소오모테 축삭 재성장, 자유롭게 성상 세포의 5,6로 뒤섞다 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 척수 손상 (SCI) 기준, 그들 중 몇몇은 말초 신경 손상 (PNI) 7,8 후 OECs를 사용했습니다.
말초 신경계는 신경 손상 후 재생하는 좋은 능력을 가지고 있지만, 완전한 절 탈선 축삭의 재성장을 유도한다. 사실, (RLN) 얼굴 또는 재발하는 후두 신경의 완전한 transections 후 잘못 전달 축삭 synkinesis라는 근육 cocontractions의 원인이됩니다. 그 때문에 축삭 재성장을 정량화 할뿐만 아니라 근육 수축의 효율성을 평가하는 PNI의 모델을 제안하는 가장 중요하다. 문헌에 기재된 대부분의 일반적인 모델은 안면 신경 병변 9,10에 기초한다. 이 모델에서 기능적 평가는 턱 (10)의 움직임에 기초하여 복구된다. 그러나 그것은 MOV의 효율성을 설명하기 복잡ements 및 근육 cocontractions 현상을 구별합니다. 우리는 여기에 RLN 병변을 기반으로 모델을 제안한다. 이 모델은 축삭 재성장과 성대의 움직임뿐만 아니라 세포 이식 (11, 12) 이후이 운동의 효율성과 기능뿐만 아니라의 평가를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RLN 섹션 / 문합 모델 OM와 OB에서 문화와 이식 OECs에 단계 절차에 의해 단계를 제공하고 수술 후 동물을 평가.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 기술은 OECs 말초 신경 손상 모델에서 세포 이식을 연구하는 유용한 모델합니다. 세포 배양 프로토콜은 비교적 간단하고 쉽게 행할 수있다. 한편, 수술 절차는 RLN의 특정 섹션 / 문합에서, 경험을 필요로하고 자격을 갖춘 기술자 만 수행해야합니다.
이 프로토콜에 설명 된 절차는 최상의 결과를 얻기 위해 포커스를 중요한 요소를 강조. 첫째, OM의 해리 동안, 우?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고를 편집하기위한 재정적 지원을 위해 박사 Fanie 나베 – 하이더에 ADIR (소재지 보조 Insuffisants Respiratoires à 보좌관)와 매그 드 난 Avenir에서 감사드립니다.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
