En. Gene Målrette å slette en Gene of Interest Denne protokollen er utformet for effektiv generering av en mutant stamme som har en målrettet genet sletting ved en definert genetisk locus. Den tidligere beskrevne T. gondii hypoksantin-xanthine-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seleksjonsmarkør er brukt i denne protokollen for sikker og pålitelig markør innsetting etter mykofenolsyre og xanthine (MPA + X) utvalg 14-16. Denne protokollen benytter en validert og kostnadseffektiv metode for å konstruere DNA målretting molekyler basert på gjær recombinational kloning 17,18. Flere alternative protokoller er kommersielt tilgjengelig for bygging av rekombinant målretting molekyler ved hjelp av bakterielle recombinational kloning metoder, in vitro recombinational kloning metoder, eller fusion PCR. Protokollen er beskrevet nedenfor gir høyest samlet effektivitet og pålitelighet for å utvinne klonet parasites besitter en målrettet genet sletting i Δ ku80 stammer av T. gondii. 1.1 Utarbeidelse av målretting DNA Tilgang ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) for å oppnå genomiske sekvenser til genet av interesse (GOI). Merk: Genomiske sekvenser bør innhentes fra Type I, II eller III genomsekvens i ToxoDB database som er nærmest den belastningen blir manipulert. For eksempel: GT1 for RH og ME49 for Pru. Design bestemte overlapping primere som forsterker 5 'og 3' genomisk rettet mot flankene av genet av interesse (GOI) som omfatter en 33 bp overlapping med gjær shuttle vektor pRS416 (eller alternativt pRS426) og innlemme en 33 bp overlapping med valgbar markør ( HXGPRT) (Tall 1A-B). Legg et unikt restriksjonsenzymsete i hver primer i begge ender av den 5 'and 3 'genomisk rettet mot flankene, plassert mellom de 33 bp overlapping, og T. gondii-spesifikk primer-sekvens (er) (figur 1A-B). Bemerk: En større enn 30 bp overlapping er nødvendig for effektiv gjær rekombinasjon kloning. De 5 'og 3' genomisk målretting flanker er utformet for å forsterke spesifikke DNA fragmenter mellom 800 og 1400 bp som definerer en målrettet sletting. Vær oppmerksom på at kortere flankene vil redusere målretting effektivitet i Δ ku80 Δ hxgprt bakgrunn 2. PCR forsterke 5 'target flanke bruke primere F1 og R1, og PCR forsterke 3'-target flanke ved hjelp av primer F2 og R2 (figur 1A-C) fra genomisk DNA tre. Separat, PCR forsterke ~ 2 KBP HXPGRT genet inkludert tilknyttede 5 'og 3' dhfr flankerer regioner av HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassett 14 bruker primere HXF og HXR(Fig. 1B-C). Merk: Forsterke målet flankene med genomisk DNA fra foreldrenes belastning å bli tilført. Merk: Plasser HXGPRT markør i forover orientering i forhold til den 5 'og 3' DNA målretting flankene for å lette påfølgende effektive genetiske manipulasjoner, slik som målrettet fjerning av HXGPRT fra forstyrret locus. Verifisere korrekte PCR-produktet størrelser ved agarose-gelelektroforese og estimere DNA-fragment under anvendelse av agarosegel-standarder eller en annen metode for å bestemme DNA-konsentrasjon. Generere kompetente gjær porsjoner som beskrevet i Gietz og Schiestly 17. Kombiner 50 ng av 5 'genomisk målretting flanke, 50 ng 3' genomisk målretting flanke, 100 ng av HXGPRT seleksjonsmarkør, og 50 ng av linearisert shuttle vector med sterilt H2O for å oppnå et sluttvolum på 10 -20 pl. Transform kompetent gjær med de tre PCR-produkter og gjær-E. coli shuttle vektor for recombinational kloning hjelp av protokollen beskrevet av Gietz og Schiestly 17. Plate transformert gjær på uracil-minus minimalt medium agarplater og inkuber ved 30 ° C i 2 – 3 dager. Bemerk: Den beordret montering av plasmidet, 5'-target flanke, den HXGPRT markør, og den 3 'target flanke lettes av konstruerte 33 bp overlapping mellom DNA-fragmentene (figurene 1A-B) og er mediert av homolog rekombinasjon i gjær. Harvest-gjær ved å tilsette 2 ml av 2x YPAD til uracil-minus-plater og forsiktig skraping å løsne kolonier uten å forstyrre agar. Sentrifuger gjær løsningen i 5 min ved 5000 xg og kast supernatanten. Resuspender pelleten gjær i 250 ul av en buffer inneholdende resuspensjon RNaseA og tilsett 50 – 100 ul av encid-vasket glassperler til løsningen. Vortex i 5 min ved den høyeste hastighet til å knuse gjærcellene. Tillat glassperlene faller til ro på bunnen av røret og supernatanten overføres til et 2 ml Eppendorf-rør. Isoler gjær DNA ved hjelp av en Miniprep DNA isolering kit, resuspendering i et endelig volum på ~ 100 ul. Bland 2 ul gjær DNA (~ 50 ng) med 40 pl av DH10B elektroporering kompetent E. coli holdt på is. Overfør løsningen til et kjølt 2 mm gap elektroporering kyvette electroporate bakteriecellene ved 2,4 kV og 129 Ω. Rescue celler ved å legge 0,8 ml SOC buljong til hver cuvette og overføring løsning til en 14 ml snap-cap Falcon tube. Inkubere cellene ved 37 ° C på en valse trommel i 40 – 60 min. Plate E. coli på 2XYT + ampicillin (AMP) og platene inkuberes platene ved 37 ° C over natten. Velg ~ 6-8 enkeltkolonier og vokse i 3 ml 2XYT + AMP til ~ 16 t ved 37 ° C. <li> Utarbeide en 30% glyserol fryser lager av hver E. coli-klone. Isolere plasmid pΔGOI fra E. coli-kloner ved hjelp av en Miniprep kit, resuspendering i et endelig volum på ~ 100 ul. Validere pΔGOI hjelp begrensning enzym fordøyer å måle DNA plasmid størrelse og verifisere den forventede pΔGOI DNA banding mønstre. Sluttføre validering av pΔGOI av DNA sekvensering av 5 'og 3' genomisk målretting flankene for å kontrollere 100% DNA sekvens basert på genomsekvens data i http://www.ToxoDB.org . Merk: I nærheten av perfekt sekvenshomologi er avgjørende for å maksimere gene targeting effektivitet tre siden hver basepar forskjellen utgjør et tilsvarende kutt i lengden perfekt homologi. Merk: genomsekvens av type II Δku80 belastning basert på Pru foreldrenes stregn er ikke tilgjengelig på dette tidspunktet. Dette arbeidet bruker type II ME49 genomsekvens som surrogat genomet for den type II Δ ku80 belastning. Basert på sekvensdata ved flere genetiske steder, er det anslått at ME49 genomet og den Pru genom oppviser enkelt-nukleotid polymorfismer ved en frekvens på ~ en per 10.000 nukleotider, eller mindre. Genererer> 200 mikrogram pΔGOI lager ved å inokulere en ~ 250 ml 2XYT + AMP natten kultur med glyserol aksjer fra en validert E. coli minipreparering klone. Isoler pΔGOI plasmid-DNA fra den store kultur ved hjelp av en maxiprep DNA isolering kit, resuspendering i et sluttvolum på 1000 pl ~. Gjenta begrensning enzym fordøyer, eller DNA sekvensering av pΔGOI maxiprep DNA for å kontrollere riktig målgruppe DNA molekyl før transfeksjon. Linearize ~ 15 mikrogram pΔGOI på 5 'enden hjelp av den unike begrensning enzym X (RE.X)fordøye nettsted bygget inn i fem "target flanke (Tall 1B). Merk: Gene targeting i T. gondii krever et minimum på ~ 10 pg av DNA-rettet til å skaffe en effektiv frekvens for å målrette annonsene hendelser på genet locus av interesse 2.. Valider linearisering av pΔGOI og bestemme DNA-konsentrasjon ved agarose-gelelektroforese eller en alternativ metode. Merk: Hvis begrensning enzym fordøyelsen på 5 'flanke ikke gir fullstendig linearisering, det utformet tre' kan unike RE.Y fordøye området brukes som et alternativt sted for linearisering av pΔGOI. Merk: En helt lineært målretting DNA molekylet er avgjørende for vellykket gene targeting ved homolog rekombinasjon i Δ ku80 stammer. Nøytralisere restriksjonsenzymet av incubating ved 68 ° C i 15 – 20 min. Forbered minst 15 pg av linearisert plasmid i 100 mikroliter sterilt H2O Butikken lineær pΔGOI ved -20 ° C inntil tidspunktet for transfeksjon. 1.2 Utarbeidelse av T. gondii parasitter, transfeksjon, valg, subkloning, validering, arkivering og vedlikehold av genetisk manipulerte stammer Generelle metoder for kulturen og manipulering av T. gondii i menneskelige forhuden fibroblast (HFF) celler er beskrevet 19-21. De Δ ku80 Δ hxgprt stammer replikere normalt i parasitt infeksjon medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) vekst medium supplert med 1% kalvefosterserum (FBS) og 1% Anti-fungal-antibiotika utvannet fra en 100x lager) 1,2. Alt arbeid med Toxoplasma gondii må utføres ved hjelp av biosikkerhet nivå to prosedyrer. T. gondii RHΔ ku80 to parental belastningen ble generert fra RHΔ hxgprt belastningen fra Roos Lab 14. Den PruΔku80 en foreldrenes belastningen ble generert fra PruΔhxgprt (Pru gniaud belastning BSG-4 22) som inneholder et stabilt integrert CAT valgbar markør og en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter under kontroll av den bradyzoite scenen promoter LDH2. Vaksinere en 25 cm 2 kolbe som inneholder konfluerende HFF celler med 1 x 10 6 levedyktig type I RH Δ ku80 Δ hxgprt parasitter, eller vaksinere to 25 cm 2 kolber med 2 x 10 6 levedyktig type II Prugniaud (Pru) Δ ku80 Δ hxgprt parasitter. Merk: Levedyktige parasitter er definert som ekstracellulære parasitter som har fersk lysert ut. Merk: </strong> Denne skalaen gir et tilstrekkelig antall levende parasitter i tre transfeksjon eksperimenter. Inspiser Δ ku80 Δ hxgprt smittet kulturer ~ 68-72 timer etter infeksjon. Verifisere tilstedeværelsen av levedyktige parasitter og ~ 90 – 95% lysis av HFF celler til å planlegge den nøyaktige timingen av transfeksjon. Merk: Isolering av fersk egressed parasitter er avgjørende for å lykkes med denne protokollen fordi lav parasitt levedyktighet vil avskaffe genet målretting effektivitet. Agitere levedyktige parasitter i løsning ved å lukke plug-tetningen lokket på 25 cm 2-kolbe og kolben ristes kraftig frem og tilbake for å agitere parasitter av av vekst overflate uten å sprute væske på innsiden av lokket eller halsen av kolben . Merk: Parasitt avling krever ikke en sprøyte-nål frigjøring protokoll for den type I ellerType II Δ ku80 stammer. Overfør den parasitt-løsning til en 10 ml sprøyte festet til en filterholder som inneholder et 3 mikrometer membran og plassere filterenheten på toppen av en åpen 15 ml skrukork-røret. Sprøyte filtrere parasittene inn i 15 ml skrukork tube. Merk: Filtrering parasitter gjennom membranen fjerner infiserte celler og cellulært avfall. Bestem parasitten konsentrasjon (tachyzoite skjemaer per ml) med en hemocytometer. Merk: Valgfritt: Ved hjelp av parasitten løsning, sette opp en plakett forming unit (PFU) analysen 21 som vil bli lest 7-8 dager senere for å bestemme tilstrekkelig levedyktighet av transfekterte parasitter (PFU å tachyzoite forholdet mellom ≥ 0,2). Pellet parasitter for 7 min ved 1400 xg og aspirer supernatanten til ~ 0,4 ml uten å forstyrre parasitten pellet. Spinn i 2 min på 1,400 xg og aspirate gjenværende supernatanten til ~ 0,01 ml uten å forstyrre parasitten pellet. Resuspender pelleten parasitt ved å sveipe bunnen av røret, og umiddelbart tilføre cytomix 23 buffer (1.33x konsentrasjon) til parasitten pellet for å oppnå en parasitt konsentrasjon av 4 – 5 x 10 7 parasitter / ml cytomix. Merk: Utelat tillegg av ATP og glutation til cytomix siden disse tilleggene ikke forbedre effektiviteten av genet målgruppe. Tine 100 pl alikvot av det lineariserte pΔGOI fra protokoll 1.1 (trinn 26). Overfør 0,3 ml av parasitten cytomix løsning (~ 1.3 til 1.6 x 10 7 parasitter) til 100 mL av lineariserte pΔGOI fra protokoll 1.1 (trinn 26), og umiddelbart overføre hele 0,4 ml parasitt + pΔGOI blanding til en kjølt 2 mm gap elektroporering cuvette. Electroporate parasitter på 1,4 kV og 24 Ω. Rest transfeksjon kyvetten ved romtemperatur i ~ 5 min og deretter overføre hele innholdet i kyvetten transfeksjon inn i en 150 cm kolbe inneholdende 2 konfluente HFF-celler med 30 ml infeksjon medium og inkuber den infiserte kulturen over natten. Begynn seleksjon i mykofenolsyre + xantin (MPA + X) ~ 20 timer post-transfeksjon (figur 2A) ved å erstatte mediet med infeksjon MPA + X utvalg medium (MPA (25 ug / ml) og xantin (50 ug / ml) i infeksjon medium). Merk: Du må ikke forstyrre incubating MPA + X utvalg kolbe. Beregn det totale antall PFUs i MPA + X utvalg kolbe ~ 8 dager etter transfeksjon ved visuelt å inspisere monolaget. Verifisere tilstedeværelse av å utvikle PFUs og sunn soner av infeksjon ved lysmikroskopi. Merk: Hvis plakk ikke er synlige etter dag 8, opprettholde utvalg og skjermen for tegn på smitteIon siden mutantstammer kan ha en redusert replikasjon hastighet. Merk: Δ ku80 Δ hxgprt parasitt stammer har en ekstremt lav bakgrunn av uønskede nontargeted hendelser, som gjør det mulig for en vellykket isolering av mutantstammer med ganske alvorlig, men ikke dødelige vekst defekter. Hvis et gen er viktig, og det kan ikke slettes, den primære transfeksjon, eller senere vedtatt parasitt befolkningen, kan avsløre en fenotype der parasittene slutte å gjenskape under valget som befolkningen vedtar å målrettede knockouts. Rist kolbe som i trinn 3 for å løsne ekstracellulære parasitter fra monolaget [etter synlige plakk har utviklet] for å generere en parasitt løsning. Transfer ~ 0,5 ml av parasitten løsning fra MPA + X utvalg kolbe til en 25 cm 2 MPA + X utvalg kolbe som inneholder konfluerende HFF celler (utpeke denne kulturen pass 1A). Løsne parasitts i de opprinnelige 150 cm 2 MPA + X utvalg kolbe ~ 3 dager senere og overføring ~ 0,5 ml parasitt-løsning til et andre 25 cm 2 MPa + X utvalg kolbe inneholdende konfluente HFF-celler (utpeke denne kulturen pass 1B). Tillate soner på infeksjon å utvikle seg i pass 1A og / eller passere 1B kolber for ~ 5 dager. Visuell kontroll ved lysmikroskopi som passerer 1A og 1B kolber inneholde minimum 25 levedyktige PFUs med sunne soner av infeksjon. Velg enten pass 1A eller pass 1B kolbe for videre passasje i MPA + X utvalg medium i 25 cm 2 kolber. Opprettholde passasje i henhold MPA + X valg. Merk: Parasitter må dyrkes for et tilstrekkelig antall generasjoner å slette ikke-integrerte vedvarende episomes fra befolkningen før subkloning. Ikke utfør subkloning før 20 dager etter transfeksjon for type I RH Δ ku80 Δ hxgprt, eller før 25 dager etter transfeksjon fortype II Pru Δ ku80 Δ hxgprt parasitter å gi tilstrekkelig tid til å fortynne ikke-integrerte episomes 1,2. Subclone parasitter i en 96-vel magasinet som inneholder konfluerende HFF celler med MPA + X utvalg medium. Tilbered en skuff i en konsentrasjon på 1 parasitt / brønn, og et andre magasin ved en konsentrasjon på 2 parasitter / brønn. Merk: subklon parasitter som nylig har lysert (~ 90 – 95% av HFF celler i 25 cm2 kolbe) for å sikre at de parasitter har høy levedyktighet. Merk: Den optimale tidsramme post-transfeksjon for subkloning ble etablert ved å måle hvor raskt lykkes målrettede parasitter oppstår på en høy frekvens i den valgte befolkningen en. Fortsett til passasjen den primære befolkningen i transfekterte parasitter i MPA + X utvalg medium med en ukentlig passasje tidsplan for å infisereen 25 cm to HFF kolbe med 10 ul av parasitt-løsning. Merk: Hvis kloner som bærer målrettet genet sletting (knockouts) ikke er hentet fra den første subkloning i trinn 18, resubclone parasitter fra kontinuerlig vedlikeholdes befolkningen ~ 10-12 uker etter transfeksjon. Merk: En av grunnene til et gen sletting er ikke innhentet oppstår fra episomal utholdenhet av noen pΔGOI plasmider. Episomal utholdenhet bestemmes av sekvensene som finnes i 5 'og 3' genomisk rettet mot flankene og ser ikke ut til å oppstå fra HXGPRT genetisk element. Ca 5 – 10% av målretting plasmider viser betydelig episomal utholdenhet som nødvendiggjør et senere tidspunkt av subkloning å la parasitten befolkningen et tilstrekkelig antall generasjon ganger for å fortynne vedvarende episomes og løse befolkningen primært stabile integranter. <ol start = "20"> Resultat 96-brønns brett 6 – 7 dager etter subkloning (Type I parasitter) eller 7-8 dager etter subkloning (type II parasitter) for brønner som inneholder en enkelt PFU, identifisert som en enkelt sone av infeksjon i lysmikroskopi ved enten 40X eller 60X makt. Mark et lite punkt på 96-brønns brett lokk for å utpeke plasseringen av PFU i brønnen. Bland innholdet i hver brønn inneholdende en enkelt PFU ved hjelp av en pipette satt til 50 ul (200 ul tip) ved å rette fluidstrøm over PFU å dispergere parasitter i brønnen. Merk: Blanding brønnen akselererer parasitten lyse av HFF monolayer. Type I RH-stammer vil lyse brønnen ~ 4 dager etter blanding, blir type II Pru parasitter lyse brønnen ~ 5 dager etter blanding. Velg et dusin lysert brønner (kloner) og bunnen langs bunnen av hver av disse lyserte brønner ved hjelp av en 0,5 – 10 mL pipettespiss samtidig som det trekkes opp 6 pl av parasitt-løsning. Transfer den 6 ul av parasitten løsning til en brønn i en 24-vel magasinet som inneholder konfluerende HFF cellene i 1 ml MPA + X utvalg medium. Merk: Det er viktig å skrape bunnen av brønnen for å holde åpningen boringen i pipettespissen i konstant kontakt med parasitter som oppholder seg på bunnen av brønnen. Overvåke 24-vel skuffen for lyse av de HFF celler. Merk: Type I RH parasitter vil typisk lyse brønnen i 24-brønnen format i ~ 4 dager. Type II Pru parasitter vil typisk lyse brønnen i ~ 5 dager. Overføring 2 mL av levedyktig parasitt løsning skrapet fra bunnen av hver brønn i 24-brønns-format til den tilsvarende brønn i en ny 24-brønns brett inneholdende konfluente HFF-celler og 1 ml MPA + X utvalg medium per brønn. Merk: Alle parasitter kloner og linjer kan være kontinuerlig viktigsteopprettholdes ved å passere to ul av levedyktig parasitt løsning hver 7. dag i denne 24-brønnen skuffen format. Kontroller at parasitter er blitt overført til en ny 24-vel skuffen ved å visuelt inspisere med lysmikroskopi ~ 18 timers post-passasjen. Høste parasitter fra lyserte brønner på 24-brønnen skuffen fra trinn 23-24 ved hjelp av enten en 1 ml eller 10 ml pipette og overføre parasitten løsning på en Eppendorf tube. Pellet parasittene ved 1400 x g i 7 min, skylles en gang i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS), og pelleten på nytt ved 1400 x g i 3 min. Sug PBS fra bunnfallet, deretter tilsett 200 pl av PBS til pelleten for å resuspendere parasitter. Fryse parasitten løsning ved -80 ° C inntil DNA-isolasjon. Isolere parasitten DNA fra hver klone med en vev DNA Minikit. Validere målrettet genet sletting (knockout) ved PCR ved hjelp av validering primere (Tall 2A-C). Test forFraværet av den funksjonelle kodende region av genet av interesse, og ved hjelp av oppstrøms-og nedstrøms CXF CXR genomisk DNA primere (figurene 2A-B) test for tilstedeværelse av PCR-produkter som spenner over de genomiske målretting flankene og HXGPRT om riktig 5 'og 3 "målrettet integrering av HXGPRT genet i den slettede genet locus. Merk: primere for valideringen må være unikt til genet av interesse eller et falskt positivt resultat kan oppnås. Grunning design kan valideres på http://www.toxodb.org ved sprengning primer sekvenser til genomet (e) for å verifisere primere er unike. Passasje parasitt kloner på en ukeplan som beskrevet i trinn 24. Når målrettet sletting er validert, er fortsatt utvalget i MPA + X valgfritt. Arkiv parasitt kloner ved å forberede fryser aksjer. Pellet ekstracellulære parasitterfra lyserte HFF celler i en 25 cm 2 kultur kolbe, fjerne media og forsiktig resuspender parasitt pellet i cellekultur frysemedium på en parasitt konsentrasjon> 4 x 10 7 parasitter per ml. Overfør delmengder til cryovials og lagre parasitter på ubestemt tid i flytende nitrogen, eller ved -80 ° C. 2. Sletting av HXGPRT Denne protokollen er designet for å fjerne HXGPRT markør fra sin integrering området i genomet av en genetisk manipulert Δ ku80 belastning. Fjerning av HXGPRT tillater markør utvinning og produksjon av stammer med flere genetiske manipulasjoner med bare valg basert på HXGPRT 1-3. Mens protokollen beskrevet nedenfor beskriver metoden for å re-målrette et geometrisk sted for å slette HXGPRT, bør det bemerkes at fjerning av HXGPRT ved gen locus av interesse også tillater samtidig re-integrasjon av villtype-genet (complementation), re-integrasjon av et mutert gen, samt re-integrering av et kodet gen-(N-eller C-terminale GFP, ha-koden, etc,), slik at for en rekke genetiske manipulasjoner. Virkningsmekanismer 24 og målretting protokoller som bruker 6-thioxanthine valg har blitt beskrevet tidligere 1-3,15. 2.1 Slett HXGPRT Avgiftsdirektoratet HXGPRT seleksjonsmarkør fra pΔGOI ved å fordøye med RE.Z å kutte på de unike restriksjonsenzymseter flankerer HXGPRT (figur 1B). Kontroller komplett fordøyelse av DNA ved agarosegel-elektroforese. Isoler den største av de to båndene fra agarosegel. Bemerk: Den største av de to båndene inneholder plasmidet sammen med 5 'og 3' DNA-mål flanker, men ikke den HXGPRT genet. Plasser agarose delen inneholder større DNA bandet i en spin kolonne laying gelen flate på membranen. Spinn kolonnen ved 13.000 x g i 4 minutter ved RT. Legg sterilt H2O til gjennomstrømningskanalen for å bringe volumet til 100 pl. Merk: Andre kommersielle metoder for å isolere DNA fra agarose. Konsentrer DNA ved EtOH nedbør, resuspending DNA i et endelig volum på 18 ul sterilt H2O Bland 1 mL av konsentrert DNA med 7 ml H2O, 1 pl 10x ligering buffer og 1 pl T4 DNA-ligase (5 enheter) og plassere den reaksjon ved 4 ° C over natten for å generere pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figur 3A). Merk: DNA-fragmenter med RE.Z som inneholder DNA-endene kan utformes og inkludert på dette trinnet for å lage plasmider egnet for målrettet re-integrasjon av vill-type genet (complementation), målrettet re-integrasjon av en mutant gen samt målrettet re-integrasjon av et kodet genet(N-eller C-terminal GFP, HA tag, etc.). Fortynne reaksjon 2x med steril H 2 O før electroporation. Transform pΔGOIc i E. coli som i protokollen 1,1 til subclone, isolere og validere målretting plasmid. Deretter linearize pΔGOIc i forberedelse til transfeksjon (se trinn 1.1.11 til 1.1.26). Gjenta parasitten transfeksjon protokollen som beskrevet i protokollen 1.2 (trinn 1-11). Merk: Før gjennomføre trinn 1 til 8, må du kontrollere at målrettet fjerning av HXGPRT er gjennomførbart i mutant belastningen. Infisere en 150 cm 2 kolbe konfluerende HFF celler med 1 x 10 6 tachyzoites av mutant belastningen med 6-thioxanthine (6TX) valg medium (200 mikrogram / ml 6TX i infeksjon medium) og plasser kolben i et PFU-analysen. Inspisere flasken åtte dager senere for å kontrollere at ingen (eller svært få, <10) PFU er synlige, som er avgjørende for å fastslå at potenrende gene targeting effektivitet vil overstige eventuelle spontan reversering av mutant belastningen til en fenotype med redusert HXGPRT uttrykk (et 6TX motstand fenotype). Merk: Ca 5 – 10% av HXGPRT integrering områder viser en betydelig og spontan frekvens av 6TX motstand selv om HXGPRT markør er fortsatt integreres ved målrettede området (se Representant Resultater avsnitt for forklaring). Begynn 6TX utvalg ~ 20 timer post-transfeksjon ved å endre mediet i 150 cm kolbe 2 til 6TX utvalg medium. Merk: Ikke forstyrr kolben for ~ 10 dager etter transfeksjon. Inspisere flasken for PFU-formasjonen på dag 10-12 etter transfeksjon (type I parasitter) eller dag 10 – 16 post-transfeksjon (type II parasitter). Merk: Parasites blir målrettet for sletting av HXGPRT vil ikke begynne å vokse under 6TX valg til HXGPRT genet og mRNA blir slettet, og den gjenværende HXGPRT protein er inaktivert. Rist utvalg kolbe for å skape et parasitt-løsning, og overføring 0,5 til 1,0 ml av parasitten løsning til en ny 25 cm 2-kolbe inneholdende konfluente HFF-celler og 5 ml 6TX utvalg medium. Gjenta overføringen fra de primære 150 cm 2 til nye 25 cm 2 kolber en gang om dagen i to dager. Merk: Flere prøvetaking øker sjansene for å fange levedyktige målrettede parasitter som har mistet HXGPRT genet. Inspiser 25 cm 2 kolber ~ 5 dager etter smitte å bekrefte tilstedeværelse av å utvikle PFUs med soner av sunne reproduserende parasitter. Pick en eller to kolber inneholdende soner av infeksjon. Merk: </sTrong> Parasitter slettet av HXGPRT genet replikere til en normal vekst i 6TX utvalg. Fortsett til passasje parasitter i 6TX utvalg medium. Subclone parasitten befolkningen etter 25-30 dager etter valget. Sett opp en 96-brønners brett med ~ en parasitt / brønn og en annen med ~ 2 parasitter / brønn. Forbered parasitt-DNA fra isolerte kloner og kloner vedlikeholde i en 24-brønns format kultur ifølge fremgangsmåte 1.2 (trinnene 19-29). Validere sletting av HXGPRT ved PCR ved hjelp av strategien skissert i figur 3A-B. 3. C-terminal Tagging av Proteiner Denne protokollen er designet for C-terminal merking av proteiner ved å målrette den koden for integrasjon via dobbel kryss over homolog rekombinasjon på genomisk locus av genet ved hjelp av MPA + X valg 2,4. Denne protokollen arbeider effektivt fordi den 5 'DHFR-sekvensen til det <em> HXGPRT markør er en fullt validert funksjonell tre 'uoversatt regionen for andre gener 2,4. 3.1 Direkte C-terminal merking av proteiner ved endogene genetiske steder Lag målretting pΔGOItag plasmidkonstruksjonen bruke gjær recombinational kloning (figur 4) og metodene som beskrives i protokollen 1.1. 5 'genomisk målretting flanke inneholder de siste 800 til 1200 bp av koding regionen (eller genomisk DNA) i GOI, unntatt oppsigelse kodon flyttes til en posisjon 3' til koden av valg (HA tag, Myc tag, Hans tag , osv.) Lag målrettet innsetting av den C-terminale kode på endogene lokus av protein-kodende genet ved å følge trinnene i protokollen 1.1 og 1.2 ved hjelp av strategien beskrevet (figur 4). Bekreft innsetting av C-terminal tag på den endogene genet locus ved hjelp av PCR-strategi. Retarget genet locus etter metoder beskrevet i protokoll 1 og protokoll 2 til delete den HXGPRT valgbar markør for å skape et presist regulert endogene genet locus som uttrykker en tagget protein. Denne protokollen også gjenoppretter det HXGPRT selekterbar markør som kan brukes på nytt for å målrette et annet locus i det kodede stamme (se protokoll 1).