コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

Summary

この記事では、マウスの脳にウイルスベクターを顕微注入すると、その後買収、絶滅と回復期を含む条件付け場所嗜好パラダイムでテストする方法を説明します。

Abstract

興味のある選択的にノックアウト遺伝子に異なるマウス脳領域にCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクトルをマイクロインジェクションすると、既存の方法に比べ、遺伝子欠失の強化された時間的及び地域固有の制御を可能にします。条件付き欠失はまた、loxPにはさまれた遺伝子を有するマウスと特異的遺伝子プロモーターの制御下でマウスを発現するCreリコンビナーゼを交配することによって達成することができるが、定位マイクロインジェクションは、関心のある実験的に決定時点で離散的な脳の領域の標的を可能にする。コカイン条件付け場所嗜好のコンテキスト、および撤退、消滅、および/または復職段階を含むことができるような自己管理や精神運動感など他のコカイン行動のパラダイムでは、この手法では、これらの個別に標的遺伝子のユニークな貢献を探索に特に有用であるコカイン誘発性可塑性のビヘイビア·モデルの位相。具体的には、この手法は、時間を越え行動への貢献をテストするための行動の離散段階で標的遺伝子の選択的切除が可能になります。最終的には、このような理解は、中毒性の行動の各段階の間に自分自身を提示する最も強力なリスク要因に対処する最善のことができる、よりター​​ゲットを絞った治療を可能にします。

Introduction

コカインは非常に強化精神刺激薬である。反復暴露に続いて、いくつかの分子や細胞適応が強迫的になると考えられている報酬関連脳回路で発生する薬物探索重大な臨床的問題¹ポーズ再発率の高さを促し、行動を。コカインは、遺伝子発現を調節することによって、これらの長期的な行動効果を発揮する。慢性コカインの使用から生じる適応を研究するために、前臨床げっ歯類モデルは、広く使用されている。そのようなモデルは、条件付け場所嗜好（CPP）パラダイムである。このモデルは、以前に中立的な環境とコカインのやりがいの特性と学び関連の開発が含まれます。特定の室とコカインのいくつかのペアリング後、動物を自由にコカインペアと非コカインペア環境を探索するために許可されていると、彼らは薬物ペアコンパートメントを好む場合は、それらは、コカイン誘発性のプラクを取得していると言われています電子好み。また、絶滅の訓練期間の後、このパラダイムはコカイン探索行動のコンテキスト固有の復職を研究するために使用することができます。

より正確に中毒性の模倣するように考えられているような長期的なコカイン誘発行動と分子可塑^2,3と自己管理（SA）を研究するために使用されている精神感、などの中毒性のような行動、他のビヘイビア·モデルに比べのような人間に見られる行動、CPPパラダイムは、コカイン文脈学習^4を勉強するための簡単な手順です。 CPPプロトコルは便利に薬物渇望のメカニズム....

Protocol

すべての手順は、ワイルコーネル医科大学制度動物実験委員会の規則に従って行われている。

1。ウイルスベクターの定位配信のための準備とセットアップ

1. 楽器、滅菌綿棒、または滅菌手袋を着用して手が非滅菌表面に接触し、破棄するかホットビーズ滅菌器を使用して再滅菌する器具によって汚染されている場合は、新しい滅菌手袋に綿棒または変更を破棄します。
2. 術後の回復のために温めるヒートブロックで寝具とマウスのケージを置きます。
3. 頭皮を殺菌するために頭とエタノールとヨウ素を剃るための電気かみそりを設定します。
4. 70％エタノールでstereotaxの耳のバーや口のホールドを拭う。
5. 5μlのハミルトンシリンジを用いて、ウイルスベクター（1×10 ⁶ウイルス粒子/μl）を5μlのを策定し、stereotaxにシリンジホルダーに設置した。
6. マイクロ波加熱パッドまたは上の電気パッドを回すstereotax上番目の場所。火傷のリスクを軽減するために、クリーン吸収パッドでカバーしています。モニタ、マウス体温（97から99.5°Fの間に）頻繁に手順全体。
7. ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（20 mg / kg体重）の混合物でマウス（22〜35グラムの間で計量）を注入。マウスを麻酔したら、マウスの反射神経をチェックして、マウスが十分に麻酔である....

Results

CPP

マイクロインジェクションマウスでCPPを実行した後、一方は制御注入のコホート（のrAAV-GFP）マウスは、通常の薬物ペアリング室（ 図1A、1B）の優先順位を取得していることを確認する必要があります。マウスは、コカインの好み（生理食塩水ペアリング室で過ごしたコカインペア室マイナス時間で費やされた時間）がベースライン嗜好（ 図1B、対B）に比べて有意に高いときに、特定のチャンバーの優先順位を取得していると考えられている。コホートとして、コントロールを注射したマウスは、コカインペア室のための優先順位を表示したり、嫌悪感を示していない、場合は、配置は組織学（rAAVの注射の項を参照）、誤った配置を持つマウスを介してすぐに確認してくださいは破棄されるべきである。

設定が正常に制御注入コホートに買収されている場合、人はその後（ 図1A開始絶滅によってパラダイムを拡張することができます図1B、E3、E4、E5対 ）に比べて著しく低い.......

Discussion

絶滅と復職段階を含むCPPと組み合わせてウイルスベクターの定位マイクロインジェクション経由地域と時間的に特異的な遺伝子アブレーションは中毒性の​​ような行動の3つの異なる段階に遺伝子の特定の貢献の調査を可能にします。伝統的なCRE-のLoxPシステムを利用して達成され、条件付きノックアウトは空間、時間的制限遺伝子アブレーションに提供していますが、定位loxP導入マウスの離散的な脳領域にCRE-リコンビナーゼをマイクロインジェクションすると、いつ、どこで遺伝子がノックアウトされているのであっても厳密に制御することができます。また、これは時々ノックアウトマウスで観察された限られた表現型変異を占める現像中に発生する代償変化の可能性を回避する。また、行動時の様々な時点で微量注入したマウスのコホートを使用して、遺伝子発現の変化や行動の変化との間に作られるべき因果関係を可能にすることができる。 IMPOrtantly、この技術は自己投与及び精神運動感作を含むいくつかの異なるコカインの行動パラダイムに適用することができる。

これは、Creリコンビナーゼの最大活性が^20を発生.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
条件付けされた場所優先活動室	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
マウス用定位固定装置アライメントシステム	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004