Тетрациклин-регулируемой клеточная линия продуцирует высоким титром лентивирусных векторов, которые специально направлены дендритных клеток
Summary
Здесь мы используем ретровирусной трансдукции и concatemeric трансфекции создать клеточную линию, которая может выразить компоненты лентивирусов вектор (LV) в отсутствие тетрациклина. Этот LV кодирующий GFP и pseudotyped с гликопротеином, SVGmu, которая является специфической для рецептором на дендритных клеток.
Abstract
Лентивирусов векторов (LV) являются мощным средством доставки генетического материала для многих типов клеток. В целях безопасности, связанные с этими ВИЧ-1, полученных векторов, производя большое количество ракет-носителей является сложной задачей. В данной работе мы сообщаем о первом способе получения высоких титров самостоятельно инактивирующий ЛВС. Мы трансдукции ретровирусом тет-офф стабильной клеточной линии производитель GPR для получения линии клеток, GPRS, который может экспрессировать все вирусные компоненты, в том числе дендритных клеток специфический гликопротеин, SVGmu. Затем мы используем concatemeric трансфекции ДНК для трансфекции передачи LV плазмиды, кодирующей репортерный ген GFP в комбинации с селективным маркером. Некоторые из полученных клонов может производить LV с титром 10 раз больше, чем то, что мы достигаем с временной трансфекции. Кроме того, эти вирусы эффективно трансдукции дендритных клеток в пробирке и генерировать сильный Т-клеточный иммунный ответ на наш репортер антигена. Этот метод может быть хорошим недопустимая кодировкат производстве сильный LV вакцины на основе клинических исследований рака или инфекционных заболеваний.
Introduction
Многие системы вектор были разработаны для доставки генов. Векторов на основе лентивирусы были одними из наиболее часто изучаются вирусная системы. Эти векторы выгодно, потому что они могут эффективно преобразовывать как деления и не делящиеся клетки 1, достижения долгосрочного выражение благодаря интеграции в геном хозяина, проявляют низкую природные анти-вектора иммунитета в большинстве человеческих популяций 2, и имеют низкий потенциал генотоксичностью от 3,4 инсерционного мутагенеза.
Производство лентивирусы всегда было окрашено безопасности. Лентивирусов векторов обычно получают из ВИЧ-1, этиологический агент СПИДа. Переходные трансфекции отдельных компонентов lentivector (передача, конверт и упаковку плазмид) является общим и гибким средством доставки генетического материала в лабораторных условиях. Тем не менее, расширение деятельности временных трансфекций для клинического применения является громоздкой и мау приводить к развитию к репликации лентивирусов 5,6. Чтобы преодолеть эти препятствия, несколько устойчивых линий упаковки и производителя клетки были разработаны 6-11. Одна из этих линий, линия упаковки GPR 11, имеет привлекательное преимущество, что они регулируются тетрациклина. В этой работе показано, как приспособить эту систему для получения самостоятельного инактивации лентивирусных векторов, которые специально ориентирована на дендритные клетки (DC-ПЗ) 12.
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее надежными антигенпрезентирующих клетках иммунной системы. Они были предметом большой интерес в развитии рака вакцины, поскольку они непосредственно инициировать, программа, и регулируют опухоль-специфического иммунного ответа 13. Включение вакцинации протокола включить ДК имеет потенциал, чтобы вызвать более сильный противоопухолевый иммунный ответ, чем пептид или ДНК-вакцин. Недавно мы разработали лентивирусный вектор, который specificallу цели дендритные клетки через изменение гликопротеина вируса Синдбис, SVGmu 14. Эти векторы уникальны тем, что они показывают высокую специфичность в дендритные клетки и генерировать сильный иммунный ответ, чем неспецифические, VSVG-pseudotyped векторов.
Мы сообщаем способ получения больших количеств этих DC-целевых лентивирусов векторов. Мы показываем, что эти DC-Lys может заразить ДК и генерируют сильные CD8 + Т-клеточный иммунный ответ. Все процедуры, связанные с животных были проведены гуманно, с одобрения USC Intitutional уходу и использованию животных комитета. Для того, чтобы выполнить в естественных условиях и клинические эксперименты, очень важно, чтобы создать линию клеток, которая может производить вирус на высоком титре. Выполнение трансдукции и трансфекции шаги в точности так, как описано максимизирует вероятность получения такого клона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы выделили способ получения больших количеств лентивирусных векторов использованием клеток 293Т стабильно трансдуцированных все лентивирусов компонентов в соответствии с тет от системы регулирования. На сегодняшний день большинство протоколов для производства лентивирусных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Чоу, Бингбинг Дай, и Лян Сяо за вклад данных для данной рукописи. Мы также признаем, доктор Джон Грей за щедрые дары реагенты, используемые в этом исследовании. PB поддерживается докторской стипендии от Национального онкологического центра. Это исследование было поддержано грантами от Национального института здоровья (R01AI68978, P01CA132681 и RCA170820A), грант от Фонда Билла и Мелинды Гейтс, грант поступательное ускорение от Объединенного центра Поступательное медицины и грант от Калифорнии ВИЧ / СПИД исследовательской программы.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
