שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים
Summary
כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.
Abstract
וקטורי lentiviral (LVS) הם אמצעי רב עוצמה להעברת חומר גנטי לסוגים רבים של תאים. בגלל חששות בטיחות הקשורות לוקטורי HIV-1 הנגזרים אלה, מפרישים כמויות גדולות של LVS הוא מאתגר. במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לייצור titers גבוהה של LVS עצמי inactivating. אנו retrovirally transduce ט פעמי היציב מפיק תא הקו GPR כדי ליצור שורת תאים, GPRS, שיכול לבטא את כל המרכיבים הנגיפיים, כולל גליקופרוטאין תא ספציפי הדנדריטים, SVGmu. לאחר מכן, אנו משתמשים transfection DNA concatemeric לtransfect קידוד פלסמיד העברת LV GFP גן כתב בשילוב עם סמן לבחירה. כמה משיבוטי כתוצאה מכך יכול לייצר LV בכייל פי 10 יותר ממה שנשיג עם transfection חולף. בנוסף, וירוסים אלה ביעילות transduce תאים דנדריטים במבחנה וליצור תגובה חיסונית חזקה תא T לאנטיגן הכתב שלנו. שיטה זו עשויה להיות אפשרות טובה עבורr ייצור חיסונים מבוססי LV חזקים למחקרים קליניים של סרטן או מחלות זיהומיות.
Introduction
מערכות וקטור רבות פותחו למסירת גן. וקטורים המבוססים על lentiviruses היו בין המערכת נגיפית למדה הנפוץ ביותר. וקטורים אלה הם יתרון משום שהם יכולים ביעילות transduce גם החלוקה ולא חלוקת תאי 1, להשיג ביטוי לטווח ארוך בשל אינטגרציה לתוך הגנום המארח, מפגין חסינות נגד וקטור טבעי נמוכה ברוב האוכלוסיות אנושיות 2, ויש להם פוטנציאל נמוך ל genotoxicity מmutagenesis insertional 3,4.
ייצור של lentiviruses מאז ומתמיד שנצבעה על ידי חששות בטיחות. וקטורי lentiviral בדרך כלל נגזרים מHIV-1, הסוכן האטיולוגי של איידס. transfection חולף של רכיבים בודדים של Lentivector (העברה, מעטפה, ופלסמידים אריזה) הוא אמצעי נפוץ וגמיש להעברת חומר גנטי בהגדרות מעבדה. עם זאת, דרוג-up transfections חולף ליישומים קליניים הוא מסורבל ואמאy להוביל להתפתחות של lentivirus שכפול מוסמך 5,6. כדי להתגבר על המכשולים הללו, שורות תאים המפיקים כמה אריזות ויציבים פותחו 6-11. יש לאחד את השורות האלה, קו אריזת GPR 11, היתרון האטרקטיבי של להיות מוסדר על ידי טטרציקלין. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד להתאים את המערכת הזו כדי לייצר וקטורי inactivating עצמי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים (DC-LVS) 12.
תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן החזקים ביותר של המערכת החיסונית. הם היו הנושא של עניין רב בפיתוח חיסון לסרטן משום שהם מפעילים ישירות, תכנית, ולווסת תגובות חיסוניות ספציפיות לגידול 13. שילוב פרוטוקול חיסון לכלול DCs יש פוטנציאל לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר חיסוני antitumor פפטיד או ה-DNA. לאחרונה, פיתחנו וקטור lentiviral שspecifically מטרות תאים דנדריטיים באמצעות שינוי גליקופרוטאין וירוס sindbis, SVGmu 14. וקטורים אלה הם ייחודיים בכך שהם מראים סגוליות גבוהים לתאים דנדריטים ולייצר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר וקטורים ספציפיים, VSVg-Pseudotyped.
כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral DC במיקוד אלה. אנו מראים כי אלה DC-LVS יכול להדביק DCs וליצור CD8 + T תגובות תא חיסוניים חזקות. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים בוצעו אנושי, תחת האישור של הטיפול בבעלי חי Intitutional USC ועדת שימוש. על מנת לבצע בניסויי vivo וקליניים, זה קריטי כדי ליצור שורת תאים שיכולים לייצר נגיף בכייל גבוה. ביצוע ההתמרה וtransfection הצעדים בדיוק כפי שתוארו יהיה למקסם את הסיכויים ליצירת שיבוט כזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו התווינו שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral באמצעות 293T תאים ביציבות transduced עם כל רכיבי lentiviral תחת ט 'את המערכת הרגולטורית. נכון להיום, רוב הפרוטוקולים לייצר וקטורי lentiviral להסתמך על transfection פוספט סידן חולפת הסטנדרטית (ראה 18, לדוגמה). גישה זו הייתה מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מייקל צ'ו, Bingbing דאי, וליאנג שיאו על תרומת הנתונים לכתב היד הזה. אנחנו גם מכירים ד"ר ג'ון גריי על המתנות הנדיבות של חומרים כימיים המשמשות במחקר זה. PB נתמך על ידי מלגת דוקטורט מהמרכז הלאומי לסרטן. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (R01AI68978, P01CA132681 וRCA170820A), מענק של ביל ומלינדה גייטס הקרן, מענק האצת translational מהמרכז המשותף לרפואת Translational ומענק מהאיידס / HIV קליפורניה תכנית מחקר.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
