Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir
Summary
Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.
Abstract
Lentiviral vektörleri (karaciğer hacimleri) hücrelerin birçok çeşit genetik materyal teslim güçlü araçlardır. LVS büyük miktarlarda üretim, bu, HIV-1 ile ilişkili elde edilen vektörler, güvenlik kaygıları nedeniyle zordur. Bu yazıda, kendi kendini inaktive karaciğer hacimleri yüksek titreleri üretmek için bir yöntem rapor. Bu retroviral olarak bir dendritik hücre-özgü glikoproteini, SVGmu de dahil olmak üzere, tüm viral bileşenler ifade edebilen bir hücre hattı, GPRS oluşturmak için tet fiyatına stabil üretici hücre hattı GPR iletmektedir. Daha sonra, sol ventrikül aktarım plazmid kodlayan bir seçilebilir marker ile bir arada bir GFP raportör gen transfekte etmek için concatemeric DNA transfeksiyon kullanın. Sonuçta elde edilen klonlar çeşitli biz geçici transfeksiyon ile elde olandan 10 kat daha fazla bir titre de LV üretebilir. Ayrıca, bu virüsler, in vitro olarak verimli bir şekilde dendritik hücrelerin transdüksiyonu ve muhabir antijene karşı güçlü bir T hücresi bağışıklık tepkisi oluşturur. Bu yöntem iyi bir seçenek olabilir for kanser veya bulaşıcı hastalıkların klinik çalışmalar için güçlü LV-tabanlı aşısı üreten.
Introduction
Birçok vektör sistemleri gen aktarımı için geliştirilmiştir. Lentivirüsler dayalı vektörler en sık çalışılan viral sistemi arasında yer almıştır. Verimli bir şekilde, hücreleri 1 bölme ve olmayan bölünmesi hem transduce nedeniyle ev sahibi genomuna entegrasyonu için uzun vadeli ifade elde, en insan nüfusu 2 düşük doğal anti-vektör bağışıklık sergi ve için düşük potansiyeline sahip, çünkü bu vektörler avantajlıdır girmeyle mutagenez 3,4 ikinci genotoksisite.
Lentivirüsler üretimi her zaman güvenlik kaygıları ile renklendi. Lentiviral vektörleri, genellikle, HİV-1, AIDS etken ajan elde edilmektedir. Lentivector tek tek bileşenleri (transfer, zarf ve ambalaj plazmid) geçici transfeksiyon laboratuvar ortamlarında genetik materyal sunma ortak ve esnek bir araçtır. Ancak, klinik uygulamalar için ölçekleme-up geçici transfections hantal ve may çoğaltma yetkili lentivirüs 5,6 gelişmesine yol açar. Bu engellerin üstesinden gelmek için, çeşitli kararlı ambalaj ve üretici hücre çizgileri 6-11 geliştirilmiştir. Bu hatlarından biri, GPR paketleme hattı 11, tetrasiklin tarafından düzenlenen olma cazip bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, özellikle dendritik hücreler (DC-LVs) 12 doğru hedeflenmektedir kendini inaktive lentiviral vektörler üretmek için bu sistem uyum nasıl gösterilmektedir.
Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin en güçlü antijen sunan hücrelerdir. Doğrudan, programı başlatmak ve tümör spesifik immün yanıtları 13 düzenleyen çünkü kanser aşısı geliştirilmesi büyük ilgi konusu olmuştur. DC peptid veya DNA aşıları daha güçlü bir anti-tümör immün yanıt ortaya çıkarmak potansiyeline sahip dahil etmek için bir aşı protokolü içeren. Son zamanlarda, bir lentiviral vektör geliştirdiğimiz specifically, bir modifiye sindbis virüsü glikoprotein, SVGmu 14 boyunca dendritik hücreler hedeflemektedir. Onlar dendritik hücreler için yüksek özgüllük göstermek ve spesifik olmayan, VSVg-pseudotyped vektörler daha güçlü bağışıklık yanıtları üreten bu vektörler benzersizdir.
Burada, bu DC-hedefli lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Biz bu DC-DC LVs bulaştırmak ve güçlü CD8 + T hücre bağışıklık yanıtı oluşturabilir göstermektedir. Hayvanlar ile ilgili tüm işlemler USC Intitutional Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında, insanca yapıldı. In vivo ve klinik deneylerde gerçekleştirmek için, bu yüksek bir titresi virüs üretebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için çok önemlidir. Aynen anlatıldığı gibi iletimi ve transfeksiyon adımları uygulayarak böyle bir klon üretme şansını maksimize edecek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, stabil olarak düzenleyici sistem kapalı Tet altında lentiviral bileşenleri ile transduse 293T hücreleri kullanılarak lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem, ana hatlarıyla. Bugüne kadar, lentiviral vektörleri üretmek için en çok kullanılan protokol (örneğin, 18), standart kalsiyum fosfat geçici transfeksiyon dayanmaktadır. Bu yaklaşım bir klinik ölçekte başarılı olmuştur, ama istikrarlı hücre hatları üretimi ölçeklendirme mevcut olması …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu yazının verileri katkıda Michael Chou, Bingbing Dai ve Liang Xiao kabul etmek istiyorum. Biz de bu çalışmada kullanılan reaktiflerin cömert hediyeler için Dr John Gray kabul. PB Ulusal Kanser Merkezi'nden bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AI68978, P01CA132681 ve RCA170820A), Bill ve Melinda Gates Vakfı, Translational Medicine için Ortak Merkezi'nden bir öteleme ivme hibe ve Kaliforniya HIV / AIDS bir hibe bir hibe hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Programı.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
