Her bruger vi retroviral transduktion og concatemeric transfektion til at skabe en cellelinie, der kan udtrykke komponenterne i en lentivirusvektor (LV) i fravær af tetracyclin. Dette LV koder GFP og pseudotype med et glycoprotein, SVGmu, som er specifik for en receptor på dendritiske celler.
Lentivirusvektorer (LVS), er et effektivt middel til at levere genetisk materiale til mange typer af celler. På grund af sikkerhedsmæssige bekymringer forbundet med disse HIV-1 afledte vektorer, der producerer store mængder af LVS er udfordrende. I dette papir, rapporterer vi en metode til fremstilling høje titre af selv-inaktiverende LVS. Vi retroviralt transducere tet-off stabil producent-cellelinje GPR at generere en cellelinie, GPRS, som kan udtrykke alle de virale komponenter, herunder en dendritisk celle-specifik glycoprotein SVGmu. Så vi bruger concatemeric DNA-transfektion til transfektion LV transferplasmidet koder et reportergen GFP i kombination med en selekterbar markør. Flere af de resulterende kloner kan producere LV på en titer 10 gange større end hvad vi opnår med transient transfektion. Plus, disse vira effektivt transducere dendritiske celler in vitro og generere en stærk T-celle immunrespons til vores reporter antigen. Denne metode kan være en god mulighed for producerer stærke LV-baserede vacciner til kliniske studier af kræft eller infektionssygdomme.
Mange vektorsystemer er blevet udviklet til genlevering. Vektorer baseret på lentivira har været blandt de mest almindeligt undersøgte viral system. Disse vektorer er fordelagtige, fordi de effektivt kan transducere både dividere og ikke-delende celler 1, opnå langsigtet udtryk grundet integration i værtsgenomet, udvise lav naturlige anti-vektor immunitet i de fleste menneskelige befolkninger 2, og har et lavt potentiale for genotoksicitet fra insertionsmutagenese 3,4.
Produktion af lentivira har altid været farvet af sikkerhedsmæssige bekymringer. Lentivirusvektorer er generelt afledt fra HIV-1, det ætiologiske agens for AIDS. Transient transfektion af enkelte komponenter i lentivector (overførsel, konvolutten, og emballage plasmider) er et almindeligt og fleksibelt middel til levering af genetisk materiale i laboratoriet indstillinger. Men opskalering forbigående transfektioner til kliniske anvendelser er tung og may føre til udvikling af replikationskompetent lentivirus 5,6. For at overvinde disse forhindringer har flere stabile emballage og producerende cellelinier blevet udviklet 6-11. En af disse linjer, GPR pakkelinie 11, har den attraktive fordel reguleres af tetracyclin. I dette papir, viser vi, hvordan du tilpasse dette system til at producere selv inaktiveringsbetingelser lentivirusvektorer, der er specifikt målrettet mod dendritiske celler (DC-LVS) 12.
Dendritiske celler (DC'er) er de mest robuste antigenpræsenterende celler i immunsystemet. De har været genstand for stor interesse i cancer-vaccine udvikling, fordi de er direkte iværksætte, program og regulere tumor-specifikke immunreaktioner 13.. Omfatter en vaccinationsprotokol at omfatte DC'er har potentiale til at fremkalde en stærkere antitumor immunrespons end peptid-eller DNA vacciner. For nylig har vi udviklet et lentivirusvektor at specifically mål dendritiske celler gennem en modificeret Sindbis virus glycoprotein SVGmu 14.. Disse vektorer er unikke i, at de viser en høj specificitet til dendritiske celler og generere kraftigere immunrespons end uspecifik, VSVG-pseudotype vektorer.
Her rapporterer vi en metode til at producere store mængder af disse DC-målrettede lentivirusvektorer. Vi viser, at disse DC-LVS kan inficere DC'er og frembringer stærke CD8 + T-celle immunrespons. Alle procedurer, der involverer dyr blev udført humant, under godkendelsen af USC Intitutional Animal Care og brug Udvalg. For at udføre in vivo og kliniske forsøg, er det afgørende at skabe en cellelinie, som kan producere virus i en høj titer. Udførelse af transduktion og transfektion trin nøjagtigt som beskrevet, vil maksimere chancerne for at generere en sådan klon.
Her har vi skitseret en fremgangsmåde til fremstilling af store mængder af lentivirusvektorer hjælp 293T celler stabilt transduceret med alle lentivirale komponenter under tet off reguleringssystem. Til dato er afhængige fleste protokoller til at producere lentivirusvektorer på standard calciumphosphat transient transfektion (se 18, for eksempel). Denne tilgang har været en succes på en klinisk skala, men den kan lide af nogle begrænsninger ikke kan være til stede i opskalering produktion fra stabile…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Michael Chou, Bingbing Dai og Liang Xiao for at bidrage data til dette manuskript. Vi anerkender også Dr. John Gray for de generøse gaver af reagenser, der anvendes i denne undersøgelse. PB er understøttet af en postdoc stipendium fra National Cancer Center. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 og RCA170820A), et tilskud fra Bill og Melinda Gates Foundation, en translationel acceleration tilskud fra Fælles Center for Translationel Medicin og en bevilling fra California HIV / AIDS forskningsprogram.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |