Summary
Biokompatibla pH-responsiva sol-gel nanosensorer kan införlivas i poly (mjölk-sam-glykolsyra) (PLGA) elektrospunna scaffolds. De producerade självrapporterings ställningar kan användas för övervakning på plats av microenvironmental förhållanden medan odling av celler på schavotten. Detta är fördelaktigt, eftersom 3D-cellulära konstruktionen kan övervakas i realtid utan att störa experimentet.
Abstract
Odla celler i 3D på lämpliga byggnadsställningar tros bättre efterlikna in vivo mikromiljön i och ökar cell-cell interaktioner. Den resulterande 3D cellulära konstruktion kan ofta vara mer relevant att studera de molekylära händelser och cell-cell interaktioner än liknande experiment studerade i 2D. För att skapa effektiva 3D-kulturer med hög cellviabiliteten hela ställningen odlingsförhållanden såsom syre och pH måste noga kontrolleras som gradienter i analytkoncentration kan existera i hela 3D-konstruktion. Här beskriver vi de metoder för framställning av biokompatibla pH-responsiva sol-gel nanosensorer och deras införande i poly (mjölk-sam-glykolsyra) (PLGA) elektrospunna ställningar tillsammans med deras efterföljande framställning för odling av däggdjursceller. PH-responsiva ställningar kan användas som verktyg för att bestämma microenvironmental pH inom en 3D cell konstruktion. Dessutom vi detalj leverans av pH reagerar nanosensors till den intracellulära miljön i däggdjursceller vars tillväxt stöddes av elektrospunna PLGA ställningar. Den cytoplasmatiska lokalisering av pH-responsiva nanosensorer kan användas för att övervaka intracellulärt pH (pHi) under pågående experiment.
Introduction
En viktig strategi i vävnadsteknik är användningen av biokompatibla material för att tillverka byggnadsställningar vars morfologi liknar den vävnad som det kommer att ersätta och är även i stånd att stödja celltillväxt och funktion 1,2. Ställningen ger mekaniskt stöd genom att cellbindning och spridning ändå tillåter cellmigration genom mellanrummen i en 3D cell konstruktion. Ställningen måste också göra det möjligt att masstransport av cell näringsämnen och inte hämmar avlägsnande av metaboliska avfall 3.
Electro har vuxit fram som en lovande metod för tillverkning av polymera byggnadsställningar kan stödja celltillväxt 4-6. De icke-vävda elektrospunna fibrer som produceras är lämpliga för celltillväxt, eftersom de ofta är porös och tillåter cell-cell interaktion samt cellmigration genom mellanrummen i en 3D cell konstruktion 7. Det är viktigt att övervaka cellernas livskraft under than period av kulturen och för att säkerställa att cellernas livskraft upprätthålls under hela den 3D-konstruktionen. Till exempel odlingsbetingelser såsom syre och pH kräver noggrann kontroll, såsom gradienter i analytkoncentrationen kan existera inom 3D-konstruktionen. Bioreaktorer eller perfusion system kan användas för att efterlikna in vivo-förhållanden interstitiell flöde och som överförings resultat ökning av näringsämnen och metaboliska sophämtning 8. Frågan om huruvida sådana system säkerställer konstant microenvironmental förhållanden kan åtgärdas genom att bedöma cellulära mikromiljön i realtid.
Nyckelmikromiljö variabler som skulle kunna övervakas i realtid, såsom: temperatur, kemisk sammansättning av cellmedia, koncentration av löst syre och koldioxid, pH och fuktighet. Av dessa mått, kan temperaturen vara lättast övervakas med hjälp av in situ sonder. Metoder för att övervaka de återstående noterade mått vanligen ivolve avlägsnande av en alikvot för provtagning och därför störa cellodlingen och ökar risken för kontaminering. Kontinuerliga realtid metoder söks. Nuvarande övervakningsmetoder förlitar sig oftast på instrument som fysiskt sondera cell konstruktion, t.ex. en pH-monitor eller syresond. Dock kan dessa påträngande metoder skadar cellulära konstruktionen och störa den pågående experiment. Icke-invasiv övervakning av analytkoncentrationer inom 3D-konstruktion skulle kunna göra det möjligt för realtidsövervakning av olika miljöaspekter som närings utarmning 9. Detta skulle möjliggöra bedömning av näringstillförsel till djupare områden inom strukturen och bestämma om metaboliska avfall tas bort effektivt 10,11. System som försöker att ta upp frågan invasivt omfattar i allmänhet användningen av en perfusion kammare som passerar odlingsmedium genom både odlingskärlet och externa sensorer för att övervaka pH, syre och glukos 12. Denre är ökande intresse för att utveckla sensorer som kan integreras direkt i odlingskärlet som inte kräver avlägsnande av en alikvot för provtagning och som sådan skulle ge in situ-övervakning.
För att åtgärda dessa brister för in situ-och icke-invasiv övervakning av microenvironmental förhållanden som vi har införlivat analyt lyhörd nanosensorer i elektrospunna byggnadsställningar för att producera självrapporterings byggnadsställningar 13. Ställningar som fungerar som avkänningsanordningar genom att övervaka fluorescensaktivitet har upprättats tidigare, där avkänningsanordningen var antingen den färdiga polymer scaffold skapad av electrospinning eller genom användning av en analytkänsliga färgämne som införlivas i polymeren före scaffold formation 14,15 . Dessa avkänningsanordningar har potential att ge felaktiga optiska utgångar som orsakas av eventuella störningar från andra analyter. Användning av en ratiometrisk avkänningsanordning sulm som de som framställts på det beskrivna protokollet har potential att eliminera dessa möjliga negativa effekter och ge en respons som är specifik för analyten i fråga.
De elektrospunna ställningar som presenteras här har framställts av den syntetiska co-polymer poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (PLGA), vald på grund av att ha Food and Drug Administration (FDA) godkännande, på grund av dess biologiskt nedbrytbara och biokompatibla egenskaper och ett spår rekord att supporta tillväxten och funktionen av olika celltyper från 16 till 18. De preparerade ratiometrisk analyt lyhörd nanosensorer är lyhörda för pH. De nanosensorer införliva två fluorescerande färgämnen i en biokompatibel sol-gel-matris där ett färgämne, är FAM reagerar på pH-värde och den andra agerar TAMRA som en inre standard, eftersom det inte reagerar på pH. Vidare kan analyseras fluorescensen av både FAM-och TAMRA separat som de inte avsevärt överlappar varandra. Bestämning av förhållandet mellan fluorescens emission av både färgämnen vid specifika våglängder ger ett pH-respons oberoende av andra miljöförhållanden. De självrapporterings ställningar möjliggör upprepning bedömning av pH på plats och i realtid utan att störa den utvecklade 3D-modellen. Vi har visat att dessa ställningar är i stånd att stödja cellvidhäftning och-proliferation och kunna anpassas till analyten i fråga. Kinetiken av sura biprodukter i konstruerade konstruktioner förblir understudied och som sådan med hjälp av pH-responsiva byggnadsställningar kan kraftigt underlätta sådana studier 19. Vidare användning av de självrapporterings ställningar för vävnadstekniska tillämpningar ger en möjlighet att till fullo förstå, övervaka och optimera tillväxten av 3D-modell vävnad konstruktioner in vitro, icke-invasivt och i realtid.
PH-responsiva nanosensorer har också levererats till den intracellulära miljön i fibroblaster odlade på electrospun PLGA scaffolDS. Förhållandet av fluorescensemissionen från de färgämnena användes för att övervaka Phi och jämfört med en självrapporteringsställnings Införliva pH nanosensorer. Leveransen av nanosensorer för celler odlade i en 3D-miljö kan möjliggöra övervakning av analytkoncentration djupt inne i konstruktionen på ett icke-förstörande sätt. Nanosensorer kan därför vara ett lönsamt imaging verktyg för icke-förstörande bedöma cellens beteende i hela 3D-konstruktioner möjliggör långsiktig analys. Screening analytkoncentrationen av enskilda celler i en 3D-konstruktion skulle kunna se till att de får tillräckligt med näringsämnen och syrehalter. Övervakning processparametrar skulle kunna bidra till att utveckla standardiserade metoder för en effektiv masstransport av syre och näringsämnen. Leveransen av nanosensorer till den intracellulära miljön och inkorporering av nanosensorer i polymera ställningar kan kombineras för bedömningar av cellviabiliteten samt byggnadsställning prestanda inom 3D constructs under vävnadstillväxtprocess. Detta kan leda till ökad kunskap om dessa konstruktioner och framsteg i tillverkning av biologiskt relevanta substitut vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Översikt
Avsnitt 1 beskriver framställningen av pH-responsiva nanosensorer och karakterisering av Nanosensorn respons på pH med hjälp av fluorescens spektrometri och deras storlek med hjälp av SEM.
Avsnitt 2 beskriver framställningen av elektrospunna polymerstöd och karakterisering av deras morfologi och storlek med hjälp av SEM. Avsnitt 2 beskriver också beredningen av självrapporterings byggnadsställningar som elektrospunna ställningar med införandet av pH-responsiva nanosensorer. De resulterande självrapporterings ställningar karakteriseras av SEM att bedöma om eventuella morfologiska förändringar i elektrospunna fibrerna har inträffat. Den fluorescens från de självrapporterings ställningar till följd av de införlivade nanosensorer bedöms av konfokalmikroskopi.
Avsnitt 3 beskriver den kultur av celler på electrospun schavotten och självrapporterings schavotten. Ställningarna är först steriliseras i preparation för cellodling fter de byggnadsställningar bedöms för att avgöra om sterilisering och kulturen av celler påverkar fluorescens förmåga de självrapporterings byggnadsställningar. Protokollet beskrivs också leverans av nanosensorer till celler som odlas på elektrospunna scaffolds. Lysotracker färgämne används för att säkerställa att nanosensorer inte har tagits i cellulära sura avdelningar.
1. Beredning och analys av pH Responsive Sol-gel Nanosensorer
1,1 Framställning av pH-Responsive sol-gel Nanosensorer
OBS: Denna beredning ska utföras i ett dragskåp.
- Förbered fluoroforer för användning inom de pH nanosensorer genom upplösning av 5 - (och-6)-karboxifluorescein, succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) i dimetylformamid (DMF) (1 ml) i en rundbottnad kolv och 6-carboxytetramethylrhodamine , succinimidylester (TAMRA-SE) (1,5 mg) i DMF (1 ml) i en annan rundbottnad kolv.Lägg 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) (1,5 ml) till varje kolv och omrördes under torr kväveatmosfär (21 ° C) under 24 tim i mörker dvs vira proverna i folie.
- Lägg båda ovanstående färgämnen (250 | il) till en blandning av etanol (6 ml) och ammoniumhydroxid (30 vikts-%, 4 ml) som finns i en rundbottnad kolv och omrördes under 1 timme (21 ° C).
- Tillsätt långsamt tetraetylortosilikat (TEOS) (0,5 ml) till blandningen, fortsätt omröringen under ytterligare 2 timmar. Blandningen blir grumlig. De nanosensorer kan uppsamlas genom rotationsindunstning. Nanosensorer kan lagras i en glasflaska vid 4 ° C för framtida användning.
VARNING: ytterligare hantering av nanosensorer i sin torra formen bör utföras i dragskåp eller i fråga om att väga dem balansen ska bifogas, till exempel i en Weighsafe.
1.2 Nanosensorn Svar på pH
- Förbered Sørensen s fosfatbuffertlösningar som sträcker sig från pH 5,5 till 8,0 av Mixing specifika förhållanden av natriumfosfat monobasiskt (0,2 M) och natriumfosfat dibasiskt (0,2 M) stamlösningar. Kontrollera det slutliga pH med användning av en pH-mätare. Vidta de smärre justeringar av pH med natriumhydroxid (NaOH) (4 M) eller saltsyra (HCI) (2 M).
- Suspendera de pH nanosensorer i pH-buffertar (5 mg / ml) genom att man först håller kärlet innehållande Nanosensorn lösningen på en vortex under 3 min sedan nedsänka kärlet i ett ultrasonicator tills lösningen blir grumlig (ca 5 min). Upprepa dessa steg för att delvis upphäva de nanosensorer i lösning.
- Placera den första lösningen i en optisk kyvett och använda excitationsvåglängder av 488 nm för 5 - (och-6)-karboxifluorescein (FAM) och 568 nm för 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Samla emissionsvåglängder vid 500-530 nm för FAM och 558-580 nm för TAMRA med hjälp av en fluorescensspektrometer.
- Ändra lösningarna i den optiska kyvetten så att pH kan observeras vid olika pH och fortsätt collecting spektra emission.
- Beräkna förhållandet mellan emissionsmaxima produceras vid varje pH-värde för att alstra en kalibreringskurva.
1.3 SEM av Nanosensorer
- Placera ett prov på nanosensorer på ett kol belagt elektronmikroskop påbörjad och spotta kappa med guld för 5 minuter under en argonatmosfär.
- Beakta genom svepelektronmikroskopi (SEM). Under avbildning justera arbetsavstånd, spänning och förstoring för att minimera elektronladdning (Figur 1).
2. Beredning och analys av PLGA Ställningar
2,1 Electro PLGA Ställningar
- I ett dragskåp upplösa poly (mjölk-sam-glykolsyra) (PLGA) i diklormetan (DCM) (20% (vikt / vikt)) med pyridinium-formiat (PF) (1% (vikt / vikt)). Placera lösningen i en 10 ml spruta med en 18 G trubbig fyllningsnålen och säkert passar till en sprutpump.
- Avstånd nålspetsen 20 cm från en 20cm x 15 cm aluminiumsamlingsplatta.
- Fäst elektroden hos en högspänningskälla till spetsen av sprutan och jorden till aluminiumuppsamlingsplattan.
VARNING: Var försiktig så hög spänning används, dvs alltid stänga av strömförsörjningen innan du tar i någon av de electro utrustningen. - Leverera lösningen med användning av en konstant flödeshastighet av 3,5 m / h vid 12 kV under 2 timmar. Electrospinning med användning av dessa förhållanden kommer att ge en scaffold djup av ca 60 | im.
- Lämna ställningen i ett dragskåp under 24 timmar för att tillåta lösningsmedlet återstod avdunsta.
2,2 Electro pH Responsive PLGA Ställningar
- Förbered byggnadsställningar som innehåller pH-responsiva nanosensorer som beskrivs i avsnitt 2.1, men med den ändringen att lägga nanosensorer till polymerlösningen (5 mg / ml). Häng nanosensorer i PLGA-lösning med hjälp av ultraljud (ca 5 min) innan att placera in i en 10 ml spruta.
2.3 SEM av PLGA Scaffold och pH Responsive Scaffold
- Placera ett prov av PLGA byggnadsställning eller pH lyhörd byggnadsställning på ett kol belagt elektronmikroskop påbörjad och fortsätt enligt beskrivningen för SEM av nanosensorer (Figur 1).
2.4 Kalibrering av pH-Responsive Scaffold
- Placera ett prov av pH lyhörd byggnadsställning i en 35 mm odlingsplatta och fördjupa sig i lämpliga buffertlösningar.
- På en konfokalmikroskop använda en 488 nm argon laser för att excitera FAM och en 568 nm krypton laser för att excitera TAMRA inom nanosensorer. Observera fluorescens utsläpp för pH-responsiva ställningar vid 500-530 nm för FAM och 558-580 nm för TAMRA. (Figur 2). Använd sekventiell skanning för att undvika insamling av excitationsvåglängder.
3. Cell Culture på PLGA Ställningar och pH Responsive PLGA Ställningar
ntent "> Anmärkning: Följande bör utföras i ett cellodlingsskåp.3,1 Framställning av PLGA Ställningar för cellodling
- Skär PLGA eller pH-responsiva PLGA ställningar i 2 cm 2 st.
- Sterilisera byggnadsställningar genom bestrålning med ultraviolett (UV) ljus på ett avstånd av 8 cm under 15 minuter på varje sida.
- Överför de ställningar till en 12-brunnars odlingsplatta och placera en ring av stål ovanpå. Tillsätt en lösning av penicillin / streptomycin (5% volym / volym) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till insidan och utsidan av stålringen, inkubera över natten (37 ° C, 5% CO2). Notera stålring tillverkades vid University of Nottingham och har följande mått: 2 cm ytterdiameter, 1 cm innerdiameter, 1 cm djup.
- Avlägsna steriliseringslösning och tvätta med PBS.
- Lägg cellodlingsmedia på insidan (500 l) och utanför (500 l) i stålring, plats i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2
- Bered en cellsuspension och utför en cellräkning med användning av en exklusion med trypanblått.
- Skapa en cellsuspension för att uppnå ett cellantal av 1 x 10 6 celler / ml.
- Ta ut mediet från insidan och utsidan av stålring.
- Ersätt med förvärmt cellodlingsmedia på utsidan av stålring (1 m).
- Addera 300 pl av cellsuspensionen till insidan av stålringen - vagga plattan fram och tillbaka försiktigt för att fördela celler.
- Placera cellodling plattan i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) - borde cellvidfästning ha skett inom 24 timmar, men fortsätt kultur så länge som försöket kräver - uppfriskande medierna var 2-3 dagar.
3.2 Nanosensorn Leverans till celler odlade på PLGA Scaffold
- Seed celler på PLGA byggnadsställning som beskrivs i avsnitt 3.1. För denna studie en tom PLGA byggnadsställning (inte behållarenNing nanosensorer) användes på grund av överlappning av fluorescensemission vid avbildande.
- Placera cellen seeded scaffold in i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 72 timmar för att tillåta cellerna att växa och migrera genom hela byggnadsställning före Nanosensorn leverans.
- Före Nanosensorn leverans tvätta cellerna med PBS och byta ut mediet från standardodlingsmedier till antibiotiska och serumfritt medium, inkuberades (37 ° C, 5% CO2) under 1 timme. Anm: standardodlingsmedier för 3T3-celler som består av Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med fetalt kalvserum (10% (v / v)), L-glutamin-lösning (2 mM), penicillin / streptomycin (1% (v / v)) .
- Under inkubationstiden förbereda Nanosensorn-liposomkomplexet genom att kort sonicating nanosensorer (5 mg) med Optimem (50 ^) för att skapa lösning A.
- Skapa lösning B genom tillsats av Lipofectamine 2000 (5 | il) till Optimem (45 | il), inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Lägg lösningA till lösning B, inkubera vid rumstemperatur under 20 min till bildning av lösning C, som är den Nanosensorn-liposom-komplex.
- Lägg lösning C (100 ^ il) till celler och inkubera (37 ° C, 5% CO2) under 3 timmar.
- Avlägsna cell seeded scaffolds från inkubatorn, aspirat media och tvätta två gånger med PBS före tillsats av PBS (1 ml) för att tillåta levande cell visualisering genom konfokalmikroskopi. Anm: PBS användes i detta protokoll, så att fenolrött-indikator är närvarande i cellodlingsmedia inte orsakade autofluorescens och också eftersom en kalibrering vid olika pH var utförs. Emellertid fritt från fenolrött medier kan användas för längre sikt-analys av cellkulturer.
- Doppa cellen seeded scaffold i buffertar med olika pH och övervaka svaret hos nanosensorer associerade med cellerna.
- Övervaka pHi genom bestämning av förhållandet mellan fluorescensintensiteterna från FAM-och TAMRA genom observation av fluorescens med användning av konfokalmikroskopi (Figure 3).
3.3 Nanosensorn plats inom däggdjursceller
- Inkubera cellerna med nanosensorer som innehåller endast FAM färgämne som beskrivs i avsnitt 3.2 (detta beror på fluorescens utsläpp av TAMRA är i samma spektrala region som Lysotracker Röd). Bered dessa nanosensorer som beskrivs i avsnitt 1.1, men med utelämnande av att förbereda och lägga TAMRA.
- Efter Nanosensorn leveransperioden späda Lysotracker Röd stamlösning till 50 nM.
- Lägg till en alikvot av det utspädda lösningen (2 pl) till celler odlade på PLGA ställningar.
- Inkubera cellerna med Lysotracker Red under 1 timme (37 ° C, 5% CO2).
- Efter inkubationsperioden avlägsna media och tvätta cellerna två gånger med PBS (pH 7,4) före ändring av media till PBS (pH 7,4) (2 ml) i förberedelse för visning med användning av konfokalmikroskopi. Anm: Fenolrött fria medier skulle kunna användas i stället för PBS.
- Lägg kärnkrafts fläcken Draq5 till PBS så att slutkoncentrationen är 5 jiM och inkubera med cellerna under 3 min (37 ° C, 5% CO2). Det är inte nödvändigt att ändra media efter inkubationstiden med DRAQ5.
- Använd en 488 nm argon laser för att excitera FAM bara nanosensorer, en 568 nm krypton laser för att excitera Lysotracker röda och 633 nm helium / neon laser för att excitera DRAQ5 kromoforen och observera fluorescens vid 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 Nm (Figur 3). Använd sekventiell skanning för att undvika insamling av excitationsvåglängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Storleksfördelningen för de preparerade pH-responsiva nanosensorer karakteriserades med hjälp av SEM, där var befolkningen i nanosensorer avbildas uppmätts och visat sig ha nanometerdimensioner i intervallet 240-470 nm (Figur 1A). Att uppnå en smal och relativt liten diameter är förenlig med hjälp av Stöber metoden att förbereda nanopartiklar. Man har funnit att användning av en basisk pH-miljö under syntesen av nanopartiklar, dvs nanopartiklar framställda med användning av den Stöber metod tillåter god kontroll av storlek, medan beredningen med användning av sura betingelser ger en bred spridning i partikelstorlek. Representativa SEM micrographs av PLGA elektrospunna fibrer framställda med användning av de beskrivna metoderna visas i figur 1B visar att den framställda PLGA scaffold består av ovävda fibrer som uppvisar minimal beading eller brott där fibrerna har nanometerdimensioner. Figur 1C figur 1B, SEM micrographs ge bevis för Nanosensorn förening på ytan av fibrerna men de kan även inkorporeras inom ställningsfibrer, kunde nedbrytnings studier av dessa scaffold / Nanosensorn scaffolds utföras i förbindelse med SEM och / eller konfokalmikroskopi för att bestämma om detta påverkar Nanosensorn prestanda.
Förmågan av nanosensorer för att behålla sin optiska aktivitet efter inkorporering i PLGA fibrerna verifierades genom att undersöka självrapporterings ställningar med hjälp av konfokalmikroskopi. Bibehållen förmåga att förbli optiskt och kemiskt aktiv om det ingår i det ställningsfibrerna kan göra det möjligt analytkoncentrationer som skall övervakas. Den fluorescens som emitteras från de nanosensorer visat att nanosensorer retained deras optiska aktivitet och som är förknippade med byggnadsställningsfibrer. Fluorescens emitterad från färgämnena FAM (grön) och TAMRA (rött) som bildats i de pH som är mottaglig nanosensorer visas i fig. 2A och 2B respektive. Detta är ett positivt resultat som gör det möjligt för analytkoncentrationer som skall övervakas i situ. Det är också första gången som optiskt aktiva ratiometriska nanosensorer har inkorporerats i PLGA-ställningsfibrer med användning av electrospinning process. Efter att ha bekräftat att nanosensorer kan visualiseras med användning av fluorescensmikroskopi efter inkorporering i PLGA-fibrer, var Nanosensorn svar på förändringar i analytkoncentrationen verifieras. Nedsänkning ställningen i buffertar med olika pH resulterade i en förändring av fluorescensintensiteten från FAM färgen medan den fluorescens som emitteras av TAMRA referens färgämnet inte märkbart förändras. Förhållandet mellan fluorescensintensiteten hos båda färgämnena kan användas för att prodUCE en kalibreringskurva såsom visas i fig. 2C. Kalibreringskurvan för nanosensorer utvärderas ensam och det ingår i electrospun PLGA byggnadsställning är jämförbara och visar att nanosensorer bibehåller sin optiska aktivitet efter inkorporering i de självrapporterings byggnadsställningar. Förmågan hos den självrapporterings scaffold att reversibelt reagera på olika pH-värden utvärderades genom att omväxlande sänka ned den byggnadsställning i buffertar med pH-värden av 5,5 och 7,5. Den reversibilitet visade sig vara mycket bra som visas i figur 2D där självrapporteringsbyggnadsställning kan uppfylla många cykliska förändringar i pH. Långtidsstudier har inte utförts för att bedöma effekten av PLGA nedbrytning på Nanosensorn bolagsordning, är det tänkt att eftersom nanosensorer ger en proportionerlig reaktion mängden nanosensorer som finns inte kommer att påverka resultatet.
Analytkänsliga nanosensorer levererades med användning av en liposomal transfektion agent till den intracellulära miljön i 3T3 fibroblaster vars tillväxt stöddes av tomma PLGA ställningar. Konfokalmikroskopi bilder av 3T3-fibroblaster odlade på tomma PLGA ställningar visar att nanosensorer är förknippade med de fibroblastcellerna med fluorescens observeras från FAM och TAMRA visas i figurerna 3A och B respektive. Liggande fluorescensen från dessa kanaler visar att fluorescensen från de två färgämnena är co-lokaliserad, vilket tyder på att färgämnena har varit anhållna inom nanosensorer "biokompatibla matris (som visat av gul fluorescens i figur 3C). De nanosensorer tros vara i cytoplasman av 3T3-fibroblaster och som inte ingår i sura fack vilket framgår av bristen på samlokaliserade fluorescens från FAM bara nanosensorer och Lysotracker röd färg visas i figur 3D. Fluorescensintensiteten av pH-responsiva nanosensors levererautgåva till 3T3-fibroblaster övervakades medan cellerna utsattes för förändringar i pH, vars resultat visas i figur 3E. Grafen som produceras visar att cellerna odlade på electrospun PLGA schavotten har upprätthållit en Phi i intervallet 6,8-7,0.
Figur 1. SEM micrographs av nanosensorer, PLGA fibrer och självrapporterings ställningar. (A) pH lyhörd sol-gel nanosensorer visar sfäriska nanometerstora partiklar (B) PLGA elektrospunna nonwoven fibrer där fiber morfologi är regelbunden med minimal beading och brytskador (C) pH lyhörd självrapporterings ställningar där nanosensorer kan observeras som sticker ut från PLGA ännu fiber morfologi fortfarande jämförbar med kontroll PLGA fibrer som inte innehåller nanoensors. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Konfokalmikroskopi bilder av pH-responsiva självrapporterings ställningar där kan observeras fluorescens från nanosensorer som är förknippade med PLGA ställningsfibrer. (A) FAM (grön) pH lyhörd färgämne och (B) TAMRA (röd) referens färgämne. (C) Kalibrerings grafer av pH-responsiva sol-gel nanosensorer och pH-responsiva byggnadsställningar demonsttakt att den optiska och kemiska reaktion av nanosensorer inte har påverkats när det ingår i PLGA schavotten fibrerna. (D) reversibilitet självrapporteringsbyggnadsställning utförs genom nedsänkning ställningen i alternativa buffertlösningar med pH 5,5 och pH 7,5. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Konfokalmikroskopi bilder av cellinternaliserade nanosensorer och diagram för pH och pHi svar. Fluorescens från internaliserade nanosensorer (A) FAM (grön) (B) TAMRA (red) (C) co-lokalisering av fluorescens från FAM och TAMRA (gul) ( D) FAM endast nanosensorer (grön) som levereras till 3T3 fibroblaster kulturd på PLGA byggnadsställning med DRAQ5 (magenta) märkning av kärnan och Lysotracker Red (röd) märkning av lysosomer. Den fluorescens för FAM och Lysotracker röd inte samlokaliserade således visar att det är osannolikt att nanosensorer har internaliserats i cellulära sura fack (E) PHI mätningar tagna från nanosensorer som levereras till 3T3-fibroblaster odlade på en tom PLGA scaffold jämfört med pH-kalibrering av ett pH-avkännande scaffold utan odling av celler. Detta visar också att pH-mätningar utförs med de internaliserade nanosensorer inte är sura eftersom cellerna odlade på electrospun PLGA schavotten har upprätthållit en Phi i intervallet 6,8-7,0. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tissue engineering har ambitionen att skapa biologiska substitut som kan användas både som in vivo som in vitro vävnadsmodeller och vävnadsersättningsterapi för att reparera, byta ut, bibehålla eller förbättra funktionen av en viss vävnad eller organ. Syntetiska substitut har använts i många år för att ersätta eller hjälp reparation av vävnader, men dessa ofta misslyckas på grund av dålig integration med värdvävnaden och / eller infektion, vilket i slutändan leder till avslag eller ytterligare revisionskirurgi. Generera levande vävnad i laboratoriet före implantation kan ta upp frågan om att uppnå full integration och minska behovet av revisionskirurgi. Men för detta mål ska förverkligas lämpliga in vitro-förökning och manipulering av celler i 3D-konstruktioner bör kombineras med lämplig fysisk konditionering av vävnaden in vitro. Detta kan uppnås på flera olika sätt varav ett är att fortsatt forskning om grundläggande biologiinblandade men också för att forska i verkstads-och tillverkningsfrågor med anknytning till produktionen av syntetiska substitut. Det är denna senare fråga som den beskrivna protokollet syftar till att bidra.
Den avsedda användningen av de beskrivna PLGA byggnadsställningar är att ge ett tillfälligt stöd till däggdjursceller för att hjälpa deras tillväxt i en biologiskt relevant struktur. Införlivandet av analyt lyhörd nanosensorer i PLGA ställningar möjliggör lokala analytkoncentrationer som skall övervakas under en 3D-konstruktion under vävnadstillväxtprocessen. Användningen av pH-responsiva byggnadsställningar möjliggör fastställandet av huruvida sura biprodukter produceras som ställnings degraderar och celler växa håller effektivt avlägsnas inifrån en 3D-konstruktion. Detta är ett steg mot att ta itu med den nuvarande bristen på processövervakning och kontroll av in vitro vävnadsregenereringsprocesser. Utnyttjandet av byggnadsställningar som är själva avkänningsanordningar kan möjliggöra isitu, realtidsmicroenvironmental bedömning. Övervakning konstruktionen mikromiljö utan att skada vävnaden är viktigt och gör att processövervakning i alla skeden av mjukpapper.
Förmågan hos den producerade pH reagerar scaffold att rapportera lokal analytkoncentrationen bestämdes genom övervakning av fluorescens som matas ut från nanosensorer med hjälp av konfokalmikroskopi. En kalibreringsexperiment utfördes för pH-avkänning scaffold och visade jämförbar med den för de pH responsiva nanosensorer inte inkorporerade i PLGA-mikrofibrer. Förmågan att producera en kalibreringskurva visar att nanosensorer kunna anpassas till förändringar i pH när de inkorporeras i polymerskelettet och också att processen för sterilisering av stöden inte orsakar några skadliga effekter på det avkännande förmågan hos pH-nanosensorer. Vidare har nanosensorer som levereras till den intracellulära miljön i celler odlade på PLGA scaffolds where cellulära svar på förändringar i Phi kan övervakas. Förhållandet mellan fluorescensintensiteterna från FAM-och TAMRA användes för att övervaka den Phi och jämfört med ett pH-värde som svarar scaffold, vilket tyder på att 3T3 fibroblastceller har upprätthållit en pHi inom intervallet pH 6,8 till 7. Inkubera 3T3-fibroblaster transfekterade med nanosensorer med den nukleära fläck DRAQ5 indikerade att majoriteten av cellassocierade nanosensorer inte var belägna i den nukleära regionen. Nanosensorn läge verkar inte vara inom sura fack såsom endosomer eller lysosomer såsom bestäms genom att inkubera Nanosensorn transfekterade 3T3-fibroblaster med Lysotracker Röd, där co-lokalisering av FAM-och Lysotracker Rött skulle vara avbildad av gula pixlar i konfokala bilder. Ytterligare studier som analys av transmissionselektronmikroskop (TEM) och identifiering av biologiska markörer för interna vägar skulle kunna verifiera detta ytterligare. Dessutom långtidsstudier såsom tidsupplöst konfokalmikroskopikan avgöra den långsiktiga öde nanosensorer i celler odlade på självrapporterings byggnadsställningar. Om nanosensorer skulle levereras till andra celltyper då deras placering bör identifieras som resultatet kanske inte är samma som den som visas här.
Användningen av självrapporterings byggnadsställningar har potential att icke-invasivt övervaka microenvironmental förhållanden inom vävnadstekniska konstruktioner. Att ha förmågan att utföra fältmätningar skulle kunna göra det möjligt att optimera tillväxten av 3D vävnad konstruktioner in vitro noninvasively och i realtid. Den cytoplasmatiska lokalisering av pH-responsiva nanosensorer kan användas för att övervaka pHi under pågående experiment. De nanosensorer som levereras till den inre miljön i celler eller självrapporterings ställningar kan både användas i statiska eller dynamiska vävnadskultursystem och kan leda till att bestämma de odlingsbetingelser som krävs för optimal tillväxt av vävnadstekniska konstruktioner ivitro. Ytterligare utveckling kan leda till en on-line-system som verkar på näringsutarmning säkerställa en jämn tillförsel av näringsämnen och syre i hela konstruktionen, slutligen ger en mycket reproducerbar metod för odling av vävnadskonstruktioner.
De beskrivna protokollen har förberett ställningar med dimensioner lämpliga för att möjliggöra avbildning med konfokalmikroskopi dock, för att möjliggöra större 3D-konstruktioner som ska avbildas multi-foton-excitation kan krävas för att möjliggöra avbildning inom djupare konstruktioner. Den optiska utrustning som används såsom mikroskoplinsen bör väljas för att bestämma den optimala arbetsavståndet för linsen och konstruktet dimensioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansiering från BBSRC är vänligt erkänt (licensnummer BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
