Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l'utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.
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Articolo metodologico
Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono varie tecniche di trasfezione cellulare e questi possono essere suddivisi a tre grandi categorie: virale, chimici e meccanici. Questo protocollo descrive un metodo meccanico per permeabilize temporalmente cellule aderenti mediante un getto di gas inerte che può facilitare il trasferimento di normalmente macromolecole non permeabili nelle cellule. Crediamo che questa tecnica funziona impartendo forze di taglio sulla membrana plasmatica di cellule aderenti, causando la formazione temporanea di micropori. Una volta che questi pori sono creati, le cellule sono poi permeabile al materiale genetico e altre biomolecole. Le forze meccaniche coinvolte non corrono il rischio di cellule permanentemente danneggiare o staccano dal loro substrato. Esiste, quindi, una ristretta gamma di dinamica dei gas inerti dove la tecnica è efficace. Un getto di gas inerte è dimostrata efficace in permeabilizzante varie linee cellulari aderenti, compresi HeLa, HEK293 e cellule endoteliali dell'aorta addominale umani. Questo protocollo è appropriato per la permeabilization di cellule aderenti sia in vitro che, come abbiamo dimostrato, in vivo, mostrando esso può essere usato per la ricerca e potenzialmente in future applicazioni cliniche. Essa ha anche il vantaggio di permeabilizzante cellule in modo spazialmente restrittiva, che potrebbe rivelarsi un valido strumento di ricerca.
Introduzione
Con l'evoluzione della biomedicina e la comprensione della meccanica delle cellule, la consegna di biomolecole nelle cellule è diventato di vitale importanza per molti settori di ricerca e le terapie mediche. Diverse tecniche sono state sviluppate per introdurre molecole estranee attraverso la membrana plasmatica e nel citoplasma cellulare. Questi possono essere generalmente classificati come: tecniche virale, chimici o meccanici. Tecniche virali possono trasfettare materiale genetico come RNA e DNA utilizzando vettori virali 1. Tecniche virali tendono ad avere alte efficienze in certe linee cellulari, tuttavia hanno il potenziale di reazioni immunitar....
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Protocollo
1. Sviluppo di LabView Programma
- Un controllore di flusso di massa (MKS M100B Mass-Flo Controller) è collegato alla linea di gas elio per garantire una portata gas precisa. Questa unità è controllata da una tensione di ingresso, compreso tra 0 e 5 V. Un circuito di controllo nel programma LabView determina la tensione richiesta in un dato momento. Interfacciamento tra il computer ed il controllore di flusso di massa è eseguita con un dispositivo di acquisizione dati (NI USB-6009), e un alimentatore 12 V fornisce alimentazione al controllore di flusso di massa.
- Due slitte di posizionamento lineari sono usati per controllare il movimento della pias....
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Risultati
Permeabilizzazione delle cellule HeLa con 10 kDa destrano fluorescente verde utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno di 0,86 millimetri capillare è mostrato in Figura 1. Le cellule sono state contrastate immediatamente dopo permeabilizzazione con 2 microlitri / ml EthD-soluzione 1 (LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità Kit) per visualizzarne la morte cellulare. Subito dopo di contrasto, vetrini sono stati montati e ripreso. Questa figura mostra risultati dell'esecuzione del getto di.......
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Discussione
Getto di gas inerte permeabilizzazione è una tecnica utile per la trasfezione di cellule aderenti. Offre la possibilità di trasferire biomolecole nelle cellule con l'uso di forze meccaniche, che elimina la necessità di prodotti chimici potenzialmente dannosi o vettori virali. La tecnica potrebbe potenzialmente offrire ai ricercatori e medici un modo efficiente e relativamente semplice per transfettare con precisione le cellule. La selettività del permeabilizzazione è unico anche consentendo ai ricercatori di trattar.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), le scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Proteina fluorescente verde per esperimenti di trasfezione su cellule HeLa |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | destrano per esperimenti di permeabilizzazione |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | per la controcolorazione di cellule di mammifero |
| Reagente antidissolvenza Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | per il montaggio di vetrini durante l'imaging |
| Helium ad altissima purezza | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ Terreni ad alto contenuto di glucosio - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | per cellule HeLa |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 26140079 | Per terreni DMEM |
| Penicillina-Streptomicina, liquida | Invitrogen | 15140-122 | Per terreni DMEM |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x | Prodotto in laboratorio | ||
| Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari | |||
| Micropiastre trattate con TC trasparenti a 6 pozzetti | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Vetrini coprioggetti | Fisher | 12-542B | |
| Capillari in vetro | World Precision Instruments | WPI Dimensionamento delle informazioni | |
| ID (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Ordine #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Regolatore di flusso di massa, serie M100B, richiede un alimentatore esterno da 12 V |
| Dispositivo DAQ USB-6009 | National Instruments | 779026-01 | |
| Gruppo UniSlide con motore passo-passo e controller | Velmex | Due gruppi UniSlide serie MA15, dotati di motori passo-passo Vexta 1.8° forniti da Velmex e controllati da un controller per motori passo-passo VXM | |
| . | Tabella 2. Elenco delle attrezzature necessarie |
Riferimenti
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al.
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Ristampe e permessi
