このプロトコルは、不活性ガスジェットを用いた接着細胞の一時的な透過化のための方法を記載している。この技術は、原形質膜を破壊する機械的な力を利用することにより接着性哺乳動物細胞への遺伝物質および生体分子の移動を容易にする。
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この記事について
サマリー
要約
様々な細胞トランスフェクション技術が存在し、これらは3つのカテゴリーに分けることができます：ウイルス、化学的および機械的。このプロトコルは、時間的に細胞内に通常は非透過性の巨大分子の伝達を容易にすることができる不活性ガスジェットを用いて付着細胞を透過性にするための機械的方法を記載する。我々は、この技術は、マイクロポアの一時的な形成をもたらす、接着細胞の原形質膜上に剪断力を付与することによって機能すると考えている。これらの孔が作成されると、次いで、細胞を遺伝物質および他の生体分子に対して透過性である。関係する機械的な力は、その基板から完全に損傷または取り外し細胞のリスクを実行します。技術が有効である不活性気体力学の狭い範囲は、したがって、存在する。不活性ガスジェットは、HeLa、HEK293およびヒト腹部大動脈内皮細胞を含む種々の接着性細胞株を効率的に透過性であることが証明されている。このプロトコルは、Pに適しています我々は、研究のために、潜在的に将来の臨床用途に使用することができる示し、 インビボで実証したように、両方のin vitroでの接着細胞のermeabilizationと、。また、貴重な研究ツールであることを証明する可能性が、空間的に限定的に細胞を透過性という利点があります。
概要
生物医学の進化と細胞の力学を理解し、細胞への生体分子の送達は、多くの研究分野や医学療法に不可欠となっています。異なる技術は、原形質膜を通って細胞サイトゾル内に外来分子を導入するために開発されてきた。ウイルス、化学的または機械的技術：これらは一般的にのいずれかとして分類することができる。ウイルス技術は、ウイルスベクター1を用いたRNAやDNAなどの遺伝物質をトランスフェクトすることができる。ウイルス技術は、しかしながら、それらは免疫および炎症反応の2の可能性を持っている、ある種の細胞株において高い効率を有する傾向がある。一般的な化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム3、細菌外毒素4とリポフェクション5での沈殿が含まれています。これらの技術は有効であることが証明されているが、特定の問題は、細胞毒性および非特異性として生じる。さらに、このようなカルシウムのような技術phosphat電子沈殿はほとんどの初代細胞6に、最大70％までしか特定の細胞株においてトランスフェクション効率を有することが見出されている。これは、特に臨床用途およびDNAの機能の研究のための様々な治療を設計する場合には、一次細胞中に入れられている研究努力を増大させるように注目すべきである。
機械的刺激を介して細胞膜の一時的な破壊は、細胞に外来分子を導入するための代替手段である。....
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プロトコル
1。 LabVIEWプログラムの開発
- マスフローコントローラ（MKS M100Bマスフロコントローラ）は、正確なガス流量を確保するために、ヘリウムガスラインに取り付けられている。このユニットは、0から5 V.のLabViewプログラム内の制御ループは、任意の時点で必要な電圧を決定するの範囲の入力電圧によって制御される。コンピュータ及びマスフローコントローラ間のインタフェースは、データ収集装置（NIのUSB-6009）によって行われ、12 V電源は、マスフローコントローラに電力を提供する。
- 二つの位置決めリニアスライドを6ウェルプレート、各方向に1つの動きを制御するために使用される。各アセンブリは、ステッピングモータと連結MA15シリーズVelmex Unislideアセンブリで構成されており、両方のアセンブリは、モータコントローラステッピングシングルVelmex VXMによって制御されます。コントローラは、各モータのマニュアルジョギングを可能にし、または外部シリアルコマンドの文字列を受け取り、特定の動きPを可能にするとの組み合わせatterns。いくつかのパターンは、所望のトーチ速度と経路の寸法を提供するようにユーザに要求する、のLabViewプログラムにプログラムすることができる。
2。機材の準備
- ヘリウムボンベとレギュレータの両方を開きます。
- モータコントローラをオンにします。
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結果
0.86ミリメートルの内径を有する毛管ヘリウムガスジェットを用いた10kDaの緑色蛍光デキストランHeLa細胞の透過処理は、 図1に示されている。細胞は、細胞死を可視化する2μL/ mlののEthD-1溶液（生/死生存率/細胞毒性キット）で、すぐに透過処理した後に染色した。すぐに対比以下、カバースリップをマウントし、画像化した。この図は、対照試料と比較して、三つの異なる出口圧力でヘリウムガスジェットを実行した結果を示す。より高い動圧および細胞死に伴って増加透過性トラック幅と効率はわずかな増加（A及びB）を示したことに留意されたい。高ダイナミック圧力に達したしかし、一旦、HeLa細胞をカバーガラスから剥離し、非常に少ない周辺透過化が発生した。細胞ストリッピングおよびトランスフェクション効率のより詳細な分析は、以前はシュイナードにより行った-ペルティエら 15
走査型電子顕微鏡研究を介して、微細孔は、細胞膜（ 図2）
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ディスカッション
不活性ガスジェット透過化は、付着細胞のトランスフェクションのために有用な技術である。これは、潜在的に有害な化学物質又はウイルスベクターの必要性を排除する機械的な力の使用で細胞に生体分子を転送する能力を提供する。技術は、潜在的に研究者や臨床医に正確に細胞をトランスフェクトするための効率的かつ比較的簡単な方法を与えることができる。透過化の選択性はまた、研究者は、複数のアプリケーションのみに有用であり得る単一コロニー内の特定の細胞を処理することを可能に独特である。
いくつかのパラメータは、毛細管ノズルの直径及び角度、ガス流量、液体と毛管高さ、細胞株、使用する標的生体分子、及び不活性ガスの種類などの個々の実験のために調整することができる。セット液レベルおよび毛細管の高さが手順に記載されており、これらの値は、我々のexperimeに関与する変数の数を最小にするように選択されたNTS。現在、実験的な流れの可視化と数値流体力学を使用してシステムをモデリングしている。これは、私たちはこのような液性などの変数に透過性の依存関係を判断できるように、私たちの細胞に与え力のより良い理解が得られます。
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開示事項
著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。
謝辞
カナダ衛生研究所（CIHR）、自然科学と工学研究評議会（NSERC）：著者は、次の資金源に感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | HeLa細胞トランスフェクション実験用緑色蛍光タンパク質 |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | 透過性実験用デキストラン |
| LIVE/DEAD 生存率/細胞毒性キット | 株式会社ライフテクノロジーズ | L3224 | for counterstaining of mammalian cells Prolong |
| Reagent Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging | Gold Antifade Reagent |
| High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | Li SH30022.01 | (HeLa細胞用 |
| シ | Invitrogen | 26140079 | DMEM培地用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン、液体 | Invitrogen | 15140-122 | DMEM培地用 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x | ラボで製造 | ||
| 表 1.必要な試薬のリスト | |||
| 6ウェルクリアTC処理マイクロプレート | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22カバースリップフィ | ッシャー12-542B | ||
| ガラスキャピラリー | World Precision Instruments | WPI サイジング情報 | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 注文 #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass Flow Controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| ステッピングモーターとコントローラーを備えたUniSlideアセンブリ | Velmex | 2シリーズMA15 UniSlideアセンブリ、Velmexが提供するVexta 1.8°Cステッピングモーターを装備し、VXMステッピングモーターコントローラー& | |
| nbsp; | 表 2. 必要な装備の一覧 |
参考文献
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al.
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再版と許可
