Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion
Summary
Une procédure en deux étapes de la collagénase de perfusion modifié pour l'isolement d'hépatocytes humains est décrit. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres foies de mammifères. Les hépatocytes isolés sont disponibles en haute rendement et la viabilité, les un modèle approprié pour la recherche scientifique dans des domaines tels que la régénération du foie, la pharmacocinétique et la toxicologie faire.
Abstract
Le foie, un organe d'une capacité de régénération exceptionnelle, effectue un large éventail de fonctions, telles que la désintoxication, le métabolisme et l'homéostasie. En tant que tel, les hépatocytes sont un modèle important pour une grande variété de questions de recherche. En particulier, l'utilisation d'hépatocytes humains est particulièrement important dans les domaines de la pharmacocinétique, la toxicologie, la régénération du foie et de la recherche de translation. Ainsi, ce procédé présente une version modifiée d'une procédure de perfusion de collagénase en deux étapes pour isoler les hépatocytes, comme décrit par une Seglen.
Auparavant, les hépatocytes ont été isolés par des méthodes mécaniques. Cependant, les méthodes enzymatiques ont été montré supérieur hépatocytes conservent leur intégrité et leur fonction structurale après isolement. Cette méthode présentée ici adapte le procédé précédemment conçu pour les foies de rats à des pièces et des résultats de foie humain dans un grand rendement des hépatocytes avec une viabilité de 77 ± 10%. Le principaldifférence de ce procédé est le processus de cannulization des vaisseaux sanguins. En outre, le procédé décrit ici peut également être appliquée à des foies provenant d'autres espèces avec foie ou des vaisseaux sanguins de tailles comparables.
Introduction
Une suspension de cellules de foie peut être préparé à partir du foie par des méthodes mécaniques ou enzymatiques. Les méthodes mécaniques utilisées pour préparer les cellules du foie entier comprennent forcer le foie à travers une étamine 2, secouant un morceau de foie avec des perles de verre dans un shaker Kahn 3, en utilisant des homogénéisateurs de verre avec des pilons en vrac 4,5 etc Au fil des ans, les méthodes mécaniques ont baissé de favoriser raison des dommages à la membrane cellulaire et la perte de la fonction des hépatocytes isolés 6,7. Par conséquent, l'utilisation d'un procédé enzymatique est actuellement la principale méthode pour l'isolement d'hépatocytes.
L'isolement des hépatocytes en utilisant une méthode enzymatique a été considérablement améliorée lorsque Berry et Friend 8 perfusées la collagénase et la hyaluronidase dans le foie via la veine porte chez des rats. Ce processus de perfusion utilisé le système vasculaire pour permettre aux enzymes de venir en contact étroit avec la majorité des cellules, conduisant àune augmentation de 6 fois le rendement des hépatocytes 8. En outre, cette méthode a donné des cellules qui ont conservé leur intégrité structurelle, avec pratiquement aucune transformation de réticulum endoplasmique dans des vésicules isolées et aucun dommage mitochondrial 8.
Cette méthode a été modifiée par une Seglen, pionnier une procédure de perfusion en deux étapes pour l'isolation des cellules du foie. Dans cette procédure, le foie de rat est perfusé avec un tampon 2 + Ca libre suivie d'une perfusion avec un tampon contenant de la collagénase de Ca 2 + 1. L'élimination de Ca 2 + dans la première étape permet de perturber les desmosomes, tandis que l'addition de Ca 2 + dans la deuxième étape est requise pour l'activité de la collagénase 1,9 optimum.
Étant donné que les travaux publiés décrite ci-dessus a été réalisée chez le rat, cet article vise à démontrer une procédure modifiée qui peut être utilisé pour l'isolement des hépatocytes avec une grande viabilité de bourdonnementun foie. L'utilisation d'hépatocytes humains reste important pour la recherche de translation et de validation des expériences utilisant des modèles animaux. Les morceaux de foie humain utilisés dans cette étude ont été acquis avec le consentement de la gouvernance à travers la Fondation de tissus humains et de cellules de recherche, une fondation contrôlée par l'État à but non lucratif 10. Après un pathologiste supprimé ce qui était nécessaire pour le diagnostic, des morceaux de foie ont été prélevés dans le tissu restant. Le tissu sectionnée par le pathologiste était morphologiquement tissus sains obtenus à partir des marges de résection après résection hépatique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole conduit à l'isolement d'hépatocytes humains à forte viabilité et de la pureté. Afin de parvenir à ces résultats, il est important de commencer par une pièce appropriée de foie. Le morceau de foie devrait avoir la capsule de Glisson intact sur toutes les surfaces à l'exception de une surface de coupe. Un autre facteur important est le lot particulier de collagénase utilisée, comme différents lots peuvent entraîner des différences marquées dans les viabilités des hépatocytes apr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible par la Fondation Human Tissue et recherche sur les cellules, ce qui rend les tissus humains disponibles pour la recherche. Le soutien financier pour ce travail a été reçu par le ministère fédéral de l'éducation et de la recherche (nom de subvention: Virtual foie réseau, le numéro de subvention: 0315759) et Hepacult GmbH. Nos remerciements vont également aux assistants techniques de la banque de tissus Hôpital Grosshadern pour la collecte des échantillons de foie et les assistants techniques de la cellule d'isolement de base Facilité pour la réalisation de la perfusion du foie et de l'isolement des hépatocytes. En particulier, nous tenons à remercier Natalja Löwen pour démontrer cette procédure dans la vidéo. Enfin, nous tenons à remercier Natalja Löwen et Edeltraud Hanesch pour créer des illustrations de la Figure 1 et les chiffres dans la vue d'ensemble schématique de la vidéo.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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