Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip
Summary
Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.
Abstract
Biz, paralel çok sayıda tek hücre içi biyomoleküllerin nicel tespitine olanak sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunmaktır. Bu amaç için, hücreler, pasif bir microchamber ortasında tutulur. Kontrol katmanı aktivasyonu üzerine, hücre küçük bir oda içinde çevreleyen hacim izole edilir. Çevredeki hacmi daha sonra izole edilmiş hücre etkilemeden değiştirilebilir. Bununla birlikte, haznenin kısa açma ve kapama sırasında, odacık içindeki çözelti birkaç yüz milisaniye içinde değiştirilebilir. Nedeniyle odaların düzelmesi için, hücreler, inkübasyon, yıkama, ve son olarak, hücre erimesi için, örneğin, bir çok kontrol edilebilir bir şekilde farklı çözüm sırayla maruz edilebilir. Sıkıca kapatılmış microchambers, lizat tutulmasını sağlayacak en aza indirmek ve hücre lizi sonrasında seyreltme kontrol eder. Parçalama ve analiz aynı yerde meydana geldiği, yüksek hassasiyet muhafaza edilir, çünkü başka bir danalitlerin ilution veya zarar taşıma sırasında ortaya çıkar. Microchamber tasarım, bu nedenle tek tek hücrelerden salınan hücre içi moleküller (attomoles, zeptomoles) çok küçük kopya numaralarının, güvenilir ve tekrarlanabilir bir analiz sağlar. Ayrıca, birçok microchambers uygun optik aletler izlenmesi için kullanılan göz önüne alındığında, aynı anda bir çok hücre analizini sağlayan bir dizi biçimde düzenlenebilir. Biz zaten hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörlerin ve göreli veya mutlak ölçülebilir şekilde ikinci haberciler analiz etmek proof-of-concept çalışmaları için bir platform kullandık.
Introduction
Geçmişte birçok çalışmalar, hücre-hücre geniş bir hücre popülasyonu içinde 1-3 farklılıklar, özellikle sinyal 4 işler ya da bu tür proteinler 5,6, metabolitleri ve kofaktörler gibi hücre içi 7,8 biyomoleküllerin miktarlarını ortaya koymuştur. Bu heterojenliklerdir hücre uyumu ve evrimi 9 için temelde önemli olabilir, ama aynı zamanda kanser 10-13 gibi hastalıkların ortaya çıkması ve tedavisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu yüzden, tek hücre düzeyinde çalışmalar, bu çalışmalar, biyolojik olarak aktif kimyasal maddeler ile muamele edildikten sonra, farklı hücresi tepkilerini ortaya çıkarmak, özellikle biyolojik ve farmakolojik araştırmalar yüksek ilgi çekmektedir.
Son yıllarda, çok sayıda analitik platformlar tek bir canlı hücrelerin analizi ya da hücre içeriği kimyasal kompozisyona geliştirilmiştir. Floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) altın st ikenandard tek bir canlı hücre çok yüksek verimli analizi için, yöntem, hücre içi veya salgılandığı bileşiklerin miktar tayini için kullanılabilir olamaz. Mikroakışkan platformların ortaya çıkması konumlandırma, tedavi ve tek hücre gözlem için yeni analitik stratejiler söz verdi. Mikroakiskan bir dönüm noktası Quake ve arkadaşları 14,15 tarafından gerçekleştirilen esnek PDMS vanaların entegrasyonu ile ulaşıldı. Onlar yonga üzerinde bölgeleri izole çünkü bu vanalar yararlıdır, örneğin iki kültürü 16 ayrı. Dahası, tek bir hücre analizi için özellikle uygun olan ve bu nedenle de bir analit sulandırma sorunlarını azaltmak için yardımcı olur. Tek hücre analizi için bu yaklaşımın gücü son Hansen ve 17 paralel olarak tek bir hücre yüzlerce gen ekspresyonunu analiz arkadaşları tarafından gösterilmiştir.
Proteinler ve metabolitleri hedeflerken, analiz nedeniyle uygun olmaması için çok zordurmplification yöntemleri, farklı buluşa ait bileşiklerin, kimyasal yapıları ve bunların varyasyonlarının çok sayıda. Ayrıca, çoğu hücre içi biyomoleküller birkaç on bin 18 sırasına göre, düşük kopya sayısında mevcut olması beklenmektedir, bu yüzden, kullanılan analitik yöntem, yüksek bir hassasiyete sahip olmalıdır. Bu tür bağışıklık ve enzim-bağlantılı bağışıklık denemeler (ELISA) gibi daha güçlü deneyleri da birkaç yıkama ve inkübasyon aşaması hem de yüzey immobilizasyon gerektiğinden mikroakışkan cihazlara entegre zordur.
Yaşanan bu zorluklar nedeniyle, bu proteinler ya da metabolitleri tek hücre düzeyinde üzerinde rakama dökülmüştür burada sadece birkaç örnek rapor edilmiş olması şaşırtıcı değildir. Örneğin, floresan bileşikleri salgılaması üzerindeki çalışmalar 19,20 bildirilmiştir. Son zamanlarda, ELISA ile uygulama, bir hücre kültüründen salgılanan (nonfluorescent) protein (THP-1 hücreleri) 21 ve bir (i analizi için sunulmuşturmmune) hücreler 10. Hücre içi proteinleri hedefleyen, Shi et al. Bir bağışıklık 11 vasıtasıyla tümör hücrelerinde sinyal yollarının analizi için hücre içi proteinlerin tanımlanmasını kolaylaştırılmış bir mikroakışkan cihaz geliştirmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin, sadece nispi miktarları tespit edilmiştir ve herhangi bir enzimatik amplifikasyon düşük bolluk proteinleri için sinyali geliştirmek için kullanıldı.
Son zamanlarda, floresan deneyleri 8 ve bağışıklık 22 ile tek-hücre yakalama mikrocihazda (Şekil 1) birleştirmek mümkün. Hücreler pasif arz ve hücrelerin herhangi bir hareketi olmadan orta ve diğer kimyasal maddelerin (hızlı) değişimine izin mikroölçülerdeki engel yapılarda, içinde sıkışıp kalırlar. Her bir tuzak etrafında halka şeklinde bir kapak, çok küçük bir hacme ("microchamber") olarak hücre izolasyonunu sağlar. Bu valf hemen o, bir hücre-yokedici (hypoosmolar) tampon tanıttıktan sonra çalıştırılırnce uzaklaşacak şekilde yayılan moleküllerin hücre içi ya da salgılanan moleküller önler. En önemli olarak, hacim (625 ul) içinde küçük boyutu, moleküllerin büyük bir seyreltme önlenir. Parçalama ve analiz çip aynı pozisyonda yapılmaktadır Bundan başka, taşıma nedeniyle analitlerin kaybı yoktur. Burada açıklanan çip tasarımı 60 microchambers toplam 7 veya 8 ya microchambers 8 alternatif satır içerir. Bir hat boyunca çapraz kontaminasyon engellenir, böylece odalar, sıralar halinde kumanda edilir.
Platform floresan denemelerinde hem de immünolojik tayinler (Şekil 1d) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Ikincisi için, çip, üretim ve montaj işlemi ile uyumlu olan antikorların, hareketsiz hale getirmek için protokoller kurulmuştur. Dolayısıyla platformu tek hücre düzeyinde, hassas, güvenilir ve ölçülebilir deneyleri için yolu açar. Şimdiye kadar, i analizi için cihaz kullanmıştırntracellular ve salgılanan enzimler (enzim deneyleri ile görece nicel), hücre içi kofaktörler, proteinler ve küçük moleküller (nokta tahlilleri ya da ELISA ile kesin miktar). Aşağıda, microcontact baskı ve yüzey kimyası vasıtası ile çok katmanlı yumuşak litografi ve antikor modelleme için protokol vasıtasıyla çip imalat sürecini tarif eder. Ayrıca, yonga kullanımı ve operasyonların bazı örnekler verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroakiskan teknoloji tek-hücre analizi için yeni ve ilginç olanaklar açtı. Özellikle, tuzak olasılığı ve mikroakışkan araçları hücreleri tek tek hareketsiz tek hücre özellikleri ve tepki üzerine sistematik kısa ve uzun vadeli çalışmalar izin verdi. Buna ek olarak, bir mikro çip üzerinde oluşturulan mikro damlacıkların yüksek frekans, hücrelerin kapsüllenmesi, geleneksel sitometrisi cihazlarla gerçekleştirilemez tek hücre salgısı çalışmalar, sağladı. Mikrodamlacık yaklaşım, an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle el yazması, özel yapılmış basınç kontrol sisteminin yapımı için C. BÄRTSCHI ve H. Benz prova okuma Tom Robinson kabul. Biz de temiz oda tesisi İLK ve hem ETH Zürich Işık Mikroskopi Merkezi (LMC) kullanımını kabul etmek istiyorum. Çalışma 7. Çerçeve Programı (ERC Grant başlayarak, proje yok. 203.428, nμLIPIDs) altında Merck Serono ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından finanse edildi.
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
