Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis
Summary
Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.
Abstract
Het zenuwstelsel wordt vaak beschreven als een hard-bedraad deel van het lichaam, zelfs al is een aanzienlijk vloeistof orgaansysteem dat reageert op externe stimuli op een consistente, stereotype wijze behoud ongelooflijke flexibiliteit en plasticiteit. Anders dan het centrale zenuwstelsel (CNS), het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is significant herstel, maar we nog maar net begonnen om de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen worden beheerst. Met behulp van zebravis als model systeem, hebben we de unieke kans om paar regeneratieve studies met in vivo beeldvorming en genetische manipulatie. Perifere zenuwen uit axonen omgeven door lagen van glia en bindweefsel. Axonen omhuld door myelinating of niet-myeliniserende Schwann-cellen, die op hun beurt verpakt in een bosje door een cellulaire schede genoemd perineurium. Na een blessure, volwassen perifere zenuwen hebben de opmerkelijke capaciteit om remove beschadigd axonale puin en re-innervate doelen. Om de rol van alle perifere glia in PNS regeneratie onderzoeken, beschrijven we hier een axon doorsnijding test die een commercieel beschikbaar stikstof-gepompte dye laser gebruikt om motorische zenuwen axotomize in levende transgene zebravis. We verder de methoden deze experimenten beschrijven paar om time-lapse imaging van gewonde en controle zenuwen. Deze experimentele paradigma kan worden gebruikt om niet alleen de rol van glia Spel zenuwregeneratie, maar ook de basis kan zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die zenuwstelsel reparatie regelen beoordelen.
Introduction
Zebravis zijn uitgebreid gebruikt om de ontwikkeling van het zenuwstelsel vanwege hun optische doorlatendheid bestuderen en het gemak van transgenese die wanneer gekoppeld, zorgen voor spectaculaire beeldvorming van dynamische cel gedrag in een levend embryo. Bovendien, omdat zebravis en zoogdieren delen vrijwel alle genen die voor zenuwstelsel vorming cellulaire en moleculaire informatie in dit modelorganisme verzameld is rechtstreeks relatable andere vertebraten. Hoewel ongelooflijk krachtig voor neurale ontwikkelingsstudies, de zebravis en de unieke eigenschappen hebben het potentieel om ook mechanismen handhaven en herstellen het zenuwstelsel na verwonding helderen. Zebravis larven behouden hun doorschijnendheid tot in de late larvale stadia en pigmentatie effectief kan worden geblokkeerd met ofwel het gebruik van farmacologische remmers van melanine productie of genetische mutanten die pigment cellen missen. Dus, met behulp van dit model organisme om letsel en regenereren studerenion bij oudere dieren is mogelijk en biedt de unieke kans om de cellulaire en moleculaire mechanismen die het zenuwstelsel te herbouwen direct te onderzoeken. In dit manuscript, beschrijven we hoe ze efficiënt en reproduceerbaar verwonden zenuwen in de PNS van zebravis larven. Dit paradigma schade leent zich niet alleen degeneratie bestuderen, maar ook de reacties van perifere glia en immuuncellen evenals de interacties tussen deze populaties tijdens de regeneratie.
Het PNS is een complex netwerk van motorische en sensorische zenuwen die noodzakelijk gegevens tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en de huid, spieren en organen van het lichaam voorbij is, waardoor een organisme te communiceren met de omgeving en overleven. Langs deze zenuwen, perifere glia, waaronder niet-myeliniserende en myeliniserende Schwann-cellen en perineurial glia, alsmede bindweefsel, omsluiten de axons en vormen uiteindelijk de volwassen zenuw. Verwondingen van deze zenuwen initieert een proces known als Wallerian degeneratie 10. Dit mechanisme van axonale fragmentatie, immuun werving, puin opruimen en regeneratie is zeer stereotiep en genetisch gereguleerd 1. Eerdere studies in zoogdieren systemen zijn de rollen van Schwann-cellen beschreven tijdens zenuw degeneratie en regeneratie 1, 2, 6, 8. In deze studies van vaste weefsel of celkweek, Schwann-cellen niet alleen geworven macrofagen om de schade ter plaatse om te helpen bij afval ophalen, maar ook geholpen in myeline fagocytose zelf. Hoewel deze studies ongelooflijk informatief zijn geweest, hebben we nooit eerder gevisualiseerd gliale reacties op perifere axon schade in vivo in real-time, en geen andere studies hebben de relatie tussen de verschillende klassen van perifere glia onderzocht tijdens deze evenementen.
Onlangs hebben diverse laboratoria Wallerian degeneratie onderzocht met behulp van zebravis en laser-gemedieerde axon verwonding vergelijkbaar met wat we hier beschrijven <sup> 4, 5, 7, 9. In een aantal van deze studies werden oppervlakkige sensorische axonen axotomized bij jonge larven met behulp van een custom-built, twee-foton confocale microscoop 4, 5, 9. In een andere studie, die is zeer vergelijkbaar met onze eigen, werden dieper axonen binnen het ventrale motorische zenuw doorgesneden in 5 dagen oude larven met behulp van een in de handel verkrijgbaar laser ablatie systeem 7. In beide experimentele set-ups, de focus lag op Wallerian degeneratie en beide axonen en afweercellen werden afgebeeld. Te breiden op deze onderzoeken, beschrijven we verwonden motorische axonen in oudere larven met meer volwassen, gemyeliniseerde zenuwen en test de respons van alle zenuw-geassocieerde perifere glia tijdens degeneratie en regeneratie.
Hiervoor doorsnijden we motorische zenuwen in 6 en 7 dagen na de bevruchting (DPF) larven en reacties van individuele gliale populaties visualiseren en de interacties tussen deze populaties samen gewonde axonen onderzoeken. Met behulp van dubbele en driedubbele transgenic lijnen die label perifere glia, zoals Schwann-cellen en perineurial glia, alsmede een merker voor axons, gebruiken we een commercieel beschikbare laserablatie bestaande uit een stikstof-gepompte dye laser (golflengte 435 nm) aan een draaiende schijf confocale systeem om axon doorsnijdingen creëren. Dit maakt experimentele set-up ons om live, larvale zebravis visualiseren, te verwonden specifieke perifere motorische axon image time-lapse van de reacties van de verschillende gliale bevolkingsgroepen traktaten en axon letsel en hun relatie tot elkaar. Dit protocol kan verder worden aangepast zenuwletsel in zebravis van verschillende leeftijden maken met verschillende transgene lijnen of genetische mutanten om verschillende wetenschappelijke vragen te beantwoorden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen van dit experimentele ontwerp zijn: 1) behoren montage larven voor schade en vervolgens in vivo beeldvorming en 2) kalibreren van de laser en de juiste energie-instellingen selecteren om een schone zenuw doorsnijding maken die resulteert in een minimale extra weefselschade . Om te helpen zorgen voor een succesvolle axotomie voor in vivo beeldvorming en daaropvolgende analyse, monteren meerdere larven in een van beide individuele glazen bodem gerechten of in een glazen bodem s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Kucenas Lab bedanken voor waardevolle discussies en Quorum Technologies, Inc voor een uitstekende technische ondersteuning. Het werk werd ondersteund door de UvA Fund for Excellence in Science and Technology (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
