Vores laboratorium udviklet en ny high-throughput automatiseret billeddannende system, der er nyttige til påvisning af flere forskellige adfærd i 7 dage gammel zebrafisk larver. Systemet kan bruges til at detektere små ændringer i adfærd, når æggene er blevet udsat for miljøgiftstoffer eller lægemidler.
Vi har skabt en ny high-throughput imaging system til analyse af adfærd i 7 dage gammel zebrafisk larver i flersporede plader. Dette system måler spontane adfærd og reaktionen på et afskrækningsmiddel stimulus, som vises til larver via en PowerPoint-præsentation. De optagne billeder analyseres med en ImageJ makro, der automatisk opdeler farvekanalerne, subtrahere baggrunden, og anvender en tærskel for at identificere individuelle larver placering i de baner. Vi kan derefter importere koordinaterne til et Excel-ark til at kvantificere svømme hastighed, præference for kant eller side af lane, hvilende adfærd thigmotaxis, afstanden mellem larver og undgåelse adfærd. Subtile ændringer i adfærd er let afsløres ved hjælp af vores system, der gør det nyttigt for adfærdsmæssige analyser efter udsættelse for giftige stoffer i miljøet eller lægemidler.
Zebrafisk bliver en populær model for genetiske, udviklingsmæssige og adfærdsmæssige videnskaber 1-4. De klækker fra deres chorions med 2-3 dage efter befrugtning (DPF), udvikler fuldt fungerende organer med 4-5 dpf, og udviser et stort antal adfærd med 7 dpf 5,6. Zebrafisk larver er velegnet til high-throughput analyser på grund af deres lille størrelse 7,8. Softwaren er kommercielt tilgængelige til automatiserede analyser af adfærd i larver og voksne zebrafisk 9-14. Dog kan denne software være dyrt og har begrænsede muligheder for at måle komplekse adfærd af zebrafisk larver i multi-brønds plader.
Vi skabte en ny high-throughput billeddannende system, der er billig at sætte op og kan kvantificere en række forskellige adfærd hos 7 dpf zebrafisk larver 15,16. Systemet giver os mulighed for hurtigt og effektivt at teste subtile adfærdsmæssige abnormiteter efter embryonale eksponering for en rækkelægemidler og miljøgiftstoffer 16-18.
Systemet blev bygget ved hjælp af træ kabinetter, som huset en digital kamera i toppen af skabet. Kameraet vender nedad til bunden af kabinettet, hvor en bærbar computer er placeret med skærmen opad 15.. Tid bortfalder billeddannelse bruges til at fange placeringen af larver i banerne. Larver kan holdes i op til fire multi-well eller flersporede plader, der er placeret på toppen af den bærbare computer skærmen. Vi bruger en PowerPoint præsentation som et afskrækningsmiddel stimulus, som larverne reagerer ved at flytte væk (undgåelse) og svømning mod kanten (thigmotaxis) 15,17. Billederne importeres til ImageJ hvor en automatiseret makro anvendes til at opdele farvekanalerne, trække baggrunden, og anvender en tærskel for at identificere individuelle larver. Koordinaterne er angivet for hver larve i hvert billede, og kan indsættes i en Excel-fil, som vi bruger til at kvantificere undgåelse og thigmotaXis adfærd, fisk at fiske distance, svømme hastighed og mængde hvile 16.
Mens vi hele tiden forbedrer vores roman adfærdsmæssige assay, har det altid været nyttigt til påvisning af undgåelse og thigmotaxis adfærd i zebrafisk larver 15.. Mange forsøg er blevet udført for at optimere resultaterne af assayet, såsom brugte farve af stimulus ideelle antal larver pr bane, og længden af adfærdsmæssige assay. Tidligere brugte vi flere brønde (med 6 eller 12 brønde) 15,17,18. Men for nylig har vi skabt romanen lane formen for at skabe en større svømning plads til larverne tillader os at samle et større antal adfærdsmæssige foranstaltninger i et enkelt assay 16 (figur 5). Andre modifikationer omfatter variationer af PowerPoint vist (ændret bevægelse eller længden af assay) og størrelsen af de baner, der anvendes (vi har også forme til mere smalle baner).
I øjeblikket er denne high-throughput automatiseret system er enestående i sin evne til at måle en stor vifte af adfærd i zebrafish larver samtidig såsom hastighed, undgåelse, nærhed til andre larver og thigmotaxis i flersporede plader. Resultater kan opnås hurtigt og et stort antal larver kan analyseres ved billeddannelse. Systemet er både billig at bygge og hurtig og nem at sætte op. En begrænsning ved dette system er, at 3-D-bevægelser ikke kan vurderes i zebrafisk larver. Automatiserede systemer der sporer voksen zebrafisk har 3-D-kapacitet og kan identificere en bredere vifte af adfærd, såsom bevægelse op eller ned i vandsøjlen 10,19. En anden begrænsning er, at vores imaging system i øjeblikket er ikke optimeret til high-throughput analyser på video hastighed. Video hastighed imaging er mulig ved indstilling af kameraet til en lavere opløsning 15, men det begrænser analysen til en enkelt plade.
Ved at bruge det nyoprettede "lane"-metoden, brug flere dele af analysen skal udføres på en præcis måde. Når du placerer larverne i than baner, er det vigtigt at sørge for væskeniveauet er meget lavvandet indtil pladerne er placeret på toppen af den bærbare computer skærmen. Hvis banerne er også fuld af væske, vil larverne undslippe ind i periferien af pladen. Desuden, når der indsættes formen i agarosen skal der drages omsorg for at sænke støbeformen meget langsomt. Hvis formen er indsat for hurtigt, vil bobler dannes i agarose og vil blive identificeret ved Image J makro som yderligere larver. Det anbefales, at hvis agarose baner har selv et par bobler, er det bedst at gøre nye.
I fremtiden vil vi gerne optimere vores adfærdsmæssige assay til at analysere andre komplekse adfærd såsom læring i zebrafisk larver og undersøge, hvordan læring kan blive påvirket af udsættelse for giftstoffer og lægemidler i den tidlige udviklingsfase. Vi arbejder i øjeblikket på analyser, der kan være nyttige til at analysere læring adfærd, hvor de adfærdsmæssige resultater kan lette bestemmelse af, hvilke områder i hjernen erpåvirket af visse giftstoffer eller lægemidler under udvikling. Automatiserede assays er blevet udviklet til at måle indlæring adfærd i zebrafisk larver 20 og disse assays kan kunne ændres til high-throughput screening ved hjælp af robuste undgåelse respons i flersporede plader.
Vi foreslår, at dette adfærdsmæssige assay kunne anvendes i fremtidige undersøgelser for at teste de udviklingsmæssige effekter af et stort antal lægemidler og giftstoffer. Sådanne undersøgelser vil give et væld af oplysninger om specifikke risikofaktorer og bidrage til etablering af bedre sundhed og sikkerhed retningslinjer for gravide kvinder og børn.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sean Pelkowski om bistand til optimering af adfærdsmæssige analyse. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 og National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 og R03 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |