En protokoll for Genetic Induksjon og visualisering av godartede og invasive tumorer i Cephalic Komplekser av<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Samarbeid mellom en aktivert onkogen som RAS ^V12 og mutasjoner i celle polaritet gener som skriblet, resultere i tumorvekst i Drosophila hvor kreftceller også vise invasive atferd. Her en enkel protokoll for induksjon og observasjon av de godartede og invasive svulster er presentert.

Abstract

Drosophila har belyst vår forståelse av det genetiske grunnlaget for normal utvikling og sykdom de siste tiårene og i dag fortsetter å bidra umåtelig til vår forståelse av komplekse sykdommer ^1-7. Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk staten er en kompleks hendelse ⁸ og har blitt modellert i Drosophila å hjelpe oss å bedre forstå det genetiske grunnlaget for denne sykdommen ^ni. Her vil jeg presentere en enkel protokoll til genetisk indusere, observere og deretter analysere utviklingen av svulster i Drosophila larver. Den tumorinduksjon teknikken er basert på det MARCM systemet ¹⁰ og utnytter samarbeidet mellom en aktivert onkogen, Ras ^V12 og tap av celle polaritet gener (scribbled, plater store og dødelig gigantiske larver) til å generere invasive tumorer ^9. Jeg viser hvordan disse svulstene kan visualiseres i intakt larver ogderetter hvordan disse kan bli dissekert ut for videre analyse. Det forenklede protokoll som presenteres her bør gjøre det mulig for denne teknikken for å bli utnyttet av etterforskerne som er interessert i å forstå rollen av et gen i tumor invasjon.

Introduction

Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk stat er et skritt klok prosess som er preget av unndragelse av beskyttende mekanismer i kroppen ^åtte. For eksempel kreftceller i kroppen må være i stand til å unngå apoptose og immunsystemet, gjennombrudd spesialisert ekstracellulære matrix (ECM) som heter Basement Membrane, og overvinne eventuelle sosiale kontroller pålagt av de omkringliggende cellene ^åtte. Det er gjennom et skritt klok progresjon at kreftcellene tilegne seg evnen til å migrere og kolonisere fjerne områder i en prosess som kalles metastasering. Vår forståelse av hvordan svulsten cellen overvinner barrierer pålagt av kroppen er fortsatt i sin spede begynnelse, men den nye bildet fra forskning gjort hittil poeng til en gjentatt bruk av normale utviklingsprosesser og signalveier ved kreftcellene ^11-13.

Frukten fly Drosophila melanogaster har bidratt enormt til vår understanding av normal utvikling og sykdom gjennom bruk av avanserte genetiske teknikker utviklet i løpet av de siste tiårene ^14-17. Bruke mutagenese og høyekspresjonsystemer verktøy vi har kommet frem til en bedre forståelse av ulike onkogener og tumor suppressor gener ^18-22. Men, er tumor metastase et resultat av samarbeid mellom flere genetiske lesjoner som har hovedsakelig blitt undersøkt i cellekultur modeller ^23,24 samt ulike xenograft modeller ^25-27. Disse modellene skjønt kraftig har sine begrensninger som de ikke etterligne helt de forholdene som finnes i en levende organisme. Videre transgene modeller tilgjengelig i mus er tungvint og ikke bidrar til genetisk analyse av invasiv atferd ^28,29. Flere studier har forsøkt å forstå invasjon av tumorceller i Drosophila ^30,31. Disse teknikkene primært utnytte transplantasjon av primære svulster til vertene, og deretter stole på sporing av transplanted svulster for invasjonen av nabo vev ^32,33. En kraftig teknikk som kalles MARCM ¹⁰ ble tilpasset av PAGLIARINI og Xu å modellere tumor invasjon i Drosophila ^ni. Denne elegante genetisk modellering av tumor invasjon utnyttet samarbeidet mellom en aktivert onkogen og tap av celle polaritet. Kraften av denne modelleringen ligger i det faktum at de invasive tumorer er skapt i et intakt organisme og dermed omgå behovet for transplantasjon av vev. For å få til den onkogene samarbeid, er et aktivert onkogen som Ras ^V12 uttrykt i kloner av celler i larve øye-antennal plate. Som et resultat av den MARCM teknikken disse kloner er også merket med grønt fluorescerende protein (GFP) for enkel visualisering og er laget homozygote for celle polaritet mutanter som dødelig giant larver, scribbled, og store plater. Resultatet er GFP merket invasive tumorer i cephalic kompleks. I denne rapporten jegvise hvordan å indusere, og visualisere disse invasive tumorer både i sammenheng med en intakt larver og dissekert ut cephalica kompleks. Den tumorinduksjon som presenteres her benytter reagenser på den andre kromosomet til Drosophila. I tabell 2, I gir en oversikt over aksjer på X og ^3. kromosomer som kan utnyttes for samme formål. Jeg tror at denne forenklede protokollen vil gjøre denne teknikken lett tilgjengelig for forskere interessert i å forstå det molekylære grunnlaget for tumorprogresjon.

Protocol

En. Induksjon av Benign Ikke-invasive svulster Bruk bestander som er oppført i tabell 2 for induksjon av godartede svulster. Forbered en startkultur for den "tester" lager av følgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP Forbered en startkultur for den "testet" lager av følgende genotype: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO Samle ti kvinnelige jomfruer fra "…

Representative Results

Som et resultat av den protokoll som presenteres her vil brukeren være i stand til å indusere godartede svulster ved overekspresjon av en aktivert onkogen i larvenes øyet antennal imaginal plate. Brukeren vil også være i stand til å indusere invasive tumorer i øynene antennal platen ved overekspresjon av en aktivert onkogen i kloner av celler også mutant for en celle polaritet genet. Tumorene kan lett visualiseres ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskop som "grønne fluorescerende" vev i hele la…

Discussion

Kreft er en kompleks sykdom med en mye bedre forståelse i dag enn tidligere. Men trenger mye fortsatt må læres og forklares før vi har et komplett bilde av de underliggende mekanismene. Den enkel protokoll er presentert her gjør det mulig å genetisk indusere godartede og invasive tumorer i en hel organisme og deretter studerer biologien i forbindelse med utviklingen av svulster i denne modellen. De fleste av de eksisterende teknikker i Drosophila og andre organismer enten bruke en cellekultur basert syste…

Materials

10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution	Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution	Invitrogen, Sigma Aldrich		Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap	Carolina Biologicals		Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative	0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde		Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket	Several		Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube	Various
Glass slides, cover glass	Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media	Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil	Polysciences Inc. or Halocarbon.com		Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish	Can be found at any general merchandise store		Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope	Leica and others		Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish	Sigma Aldrich
Paint Brush	Can be found at any general merchandise store
			Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.