Analys av fettsyrasammansättning och sammansättning i Mikroalger

Summary

Ett förfarande för bestämning av fettsyrainnehållet och komposition i mikroalger baserat på mekanisk cellstörning, lösningsmedelsbaserade lipidextraktion, transförestring, och kvantifiering och identifiering av fettsyror med användning av gaskromatografi beskrivs. En tripentadecanoin intern standard används för att kompensera för eventuella förluster under extraktion och ofullständig omförestring.

Abstract

En metod för att fastställa innehållet och sammansättningen av de totala fettsyrorna i mikroalger beskrivs. Fettsyror är en viktig beståndsdel i mikroalger biomassa. Dessa fettsyror kan vara närvarande i olika acyl-lipid-klasserna. Speciellt fettsyrorna i triacylglycerol (TAG) är av kommersiellt intresse, eftersom de kan användas för framställning av drivmedel, kemikalier i bulk, nutraceuticals (ω-3-fettsyror), och livsmedelsråvaror. Att utveckla kommersiella tillämpningar, behövs tillförlitliga analysmetoder för kvantifiering av fettinnehållet syra och sammansättning. Mikroalger är enskilda celler omgivna av en styv cellvägg. En fettsyra analysmetod bör ge tillräcklig cellstörningar att befria alla acyl lipider och utvinning förfarande som används ska kunna extrahera alla acyl lipid klasser.

Med den metod som presenteras här alla fettsyror som föreligger i mikroalger kan vara exakt och reproducerbart identifieras och kvantifieras med hjälp av små mängder av prov (5 mg) som är oberoende av deras kedjelängd, graden av omättnad, eller lipid klass de är en del av.

Denna metod ger inte information om den relativa förekomsten av olika fettklasser, men kan förlängas för att separera lipidklasser från varandra.

Metoden bygger på en sekvens av mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till fettsyrametylestrar (Fames), samt kvantifiering och identifiering av FAMEs hjälp av gaskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tillsättes före den analytiska procedur för att korrigera för förluster under utvinning och ofullständig omestring.

Introduction

Fettsyror är en av de viktigaste beståndsdelarna i mikroalger biomassa och utgör typiskt mellan 5-50% av den celltorrvikt ^1-3. De är i huvudsak närvarande i form av glycerolipider. Dessa glycerolipider i sin tur består huvudsakligen av fosfolipider, glykolipider, och triacylglycerol (TAG). Speciellt fettsyrorna i TAG är av kommersiellt intresse, eftersom de kan användas som en resurs för produktion av drivmedel, bulkkemikalier, nutraceuticals (ω-3 fettsyror) och livsmedelsråvaror ^3-6. Mikroalger kan växa i havsvatten baserad odlingsmedier, kan ha en mycket större areal produktivitet än landlevande växter, och kan odlas i photobioreactors på platser som är olämpliga för jordbruk, kanske till havs. Av dessa skäl är mikroalger ofta som ett lovande alternativ till landväxter för produktion av biodiesel och andra bulkprodukter ^3-6. Potentiellt ingen jordbruks loch eller sötvatten (när odlas i slutna photobioreactors eller när marina mikroalger används) är nödvändigt för deras produktion. Därför är biobränslen från mikroalger anses ^{3: e} generationens biobränslen.

Den totala cellulära halten av fettsyror (i% av torrvikt), lipid klass sammansättning, liksom fettsyra längd och mättnadsgrad är mycket variabla mellan mikroalger. Dessutom är dessa egenskaper varierar med odlingsbetingelser, såsom tillgången på näringsämnen, temperatur, pH, och ljusintensitet ^1,2. Till exempel, när den utsätts för kväve svält, kan mikroalger ackumulera stora mängder av TAG. Under optimala tillväxtbetingelser utgör TAG typiskt mindre än 2% av torrvikt, men när de utsätts för kväve svält TAG innehåll kan öka upp till 40% av mikroalger torrvikt ^1.

Mikroalger producerar främst fettsyror med kedjelängd av 16 och 18kolatomer, men vissa arter kan göra fettsyror med upp till 24 kolatomer i längd. Både mättade, samt höggradigt omättade fettsyror produceras av mikroalger. De senare inkluderar fettsyror med näringsmässiga fördelar (ω-3 fettsyror) som C20: 5 (eikosapentaensyra, EPA) och C22: 6 (dokosahexaensyra, DHA) för vilka inga vegetabiliska alternativ finns ^1,2,4,7. Den (fördelning) fettsyra kedjelängd och mättnadsgrad avgör också de egenskaper och kvalitet av alger-derived biobränsle, matolja ^4,8.

Att utveckla kommersiella tillämpningar av mikroalgsamhällen härledda fettsyror, behövs tillförlitliga analysmetoder för kvantifiering av fettinnehållet syra och sammansättning.

Som också påpekats av Ryckebosch et al. ^9, analys av fettsyror i mikroalger skiljer sig från andra substrat (t.ex. vegetabilisk olja, livsmedel, djurvävnader etc.) varaorsaka en) mikroalger är enskilda celler omgivna av styva cellväggar, vilket komplicerar lipidextraktion; 2) mikroalger innehålla ett stort antal olika lipidklasser och fördelningen lipid klass är mycket variabel ^7. Dessa olika lipid klasser har ett brett utbud i kemisk struktur och egenskaper såsom polaritet. Dessutom är andra än acyl lipider lipidklasser produceras, 3) mikroalger innehåller en mängd olika fettsyror, som sträcker sig från 12 till 24 kolatomer i längd och innehåller både mättade, samt mycket omättade fettsyror. Därför metoder som utvecklats för att analysera fettsyror i andra än mikroalger substrat, kanske inte lämpar sig för att analysera fettsyror i mikroalger.

Som granskas av Ryckebosch m fl. ^9, är den största skillnaden mellan vanligen används extraktion lipid i lösningsmedelssystem som används. På grund av den stora variationen av lipid klasser som finns i mikroalger, vart och ett varierar i polaritet, den extraheradelipid kvantitet varierar med lösningsmedel som används ^10-12. Detta leder till inkonsekvenser i fettinnehållet och sammansättning som presenteras i litteraturen ^9,10. Beroende på lösningsmedelssystemet som används, metoder baserade på lösningsmedelsextraktion utan avbrott cell genom exempelvis, bead stryk eller ultraljudsbehandling, kanske inte extrahera alla lipider på grund av den stela vissa mikroalger arter ^9,13. I fallet med ofullständig lipidextraktion kan extraktionseffektivitet av de olika lipidklasser variera ^14. Detta kan också ha en effekt på den uppmätta fettsyrakompositionen, eftersom fettsyrakompositionen är variabel bland lipidklasser ^7.

Vår metod bygger på en sekvens av mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till fettsyrametylestrar (Fames), samt kvantifiering och identifiering av FAMEs hjälp av gaskromatografi i kombination med en flamma ionization detektor (GC-FID). En inre standard i form av en triacylglycerol (tripentadecanoin) läggs innan analysmetoden. Möjliga förluster under extraktion och ofullständig omförestring kan sedan korrigeras för. Metoden kan användas för att bestämma innehållet och sammansättningen av fettsyrorna i mikroalger biomassa. Alla fettsyror som finns närvarande i de olika acyl-lipid-klasser, inklusive lagring (TAG) liksom membranlipider (glykolipider, fosfolipider), detekteras, identifieras och kvantifieras på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt genom denna metod med användning av endast små mängder av prov (5 mg) . Denna metod ger inte information om den relativa förekomsten av olika fettklasser. Emellertid kan förfarandet utvidgas till att separera lipidklasser från varandra ^1. Koncentrationen och fettsyrakompositionen av de olika lipidklasser kan därefter bestämmas individuellt.

I litteraturen flera andra metoder ärbeskrives för att analysera lipider i mikroalger. Vissa metoder fokuserar på totala lipofila komponenter ^15, medan andra metoder fokuserar på totala fettsyror ^9,16. Dessa alternativ inkluderar gravimetrisk bestämning av det totala extraherade lipider, direkt transförestring av fettsyror i kombination med kvantifiering med hjälp av kromatografi, och färgade celler med lipofila fluorescerande färger.

Ett alternativ som ofta används till kvantifiering av fettsyror med hjälp av kromatografi är kvantifiering av lipider med en gravimetrisk bestämning ^17,18. Fördelar med en gravimetrisk bestämning är att det saknas krav på avancerad och dyr utrustning som en gaskromatograf, lätt att ställa in förfarandet, på grund av tillgången på standardiserade analysutrustning (t.ex. Soxhlet) och en gravimetrisk bestämning är mindre tidskrävande än kromatografi baserade metoder. Den stora fördelen med användning av kromatografi baserad metoder på OTHer hand är att endast de fettsyror i en sådan metod mäts. I en gravimetrisk bestämning av icke-fettsyra som innehåller lipider, såsom pigment eller steroider, ingår också i bestämningen. Dessa icke-fettsyra-innehållande lipider kan göra upp en stor andel (> 50%) av totala lipider. Om man endast är intresserad av att halten av fettsyror (t.ex. för biodiesel applikationer), kommer det att överskattas när en gravimetrisk bestämning används. Dessutom, i en gravimetrisk bestämning noggrannhet analysvåg som skall användas för att väga de extraherade lipider avgör provstorleken som måste användas. Denna mängd är oftast mycket mer än den mängd som behövs vid kromatografi används. Slutligen är en annan fördel med användning av kromatografi över gravimetrisk bestämning att kromatografi ger information om fettsyrasammansättningen.

Ett annat alternativ till vår presenterade metoden direkt transesterifiering ^16,19,20.I denna metod lipidextraktion och transförestring av fettsyror till FAMEs kombineras i ett steg. Denna metod är snabbare än en separat extraktion och transesterifiering steg, men att kombinera dessa steg begränsar lösningsmedlen som kan användas för extraktion. Detta kan negativt påverka extraktionseffektivitet. En annan fördel med en separat lipidextraktion och transesterifiering steg är att det möjliggör för en extra lipidklass separationen mellan dessa steg ^1. Detta är inte möjligt när direkt omförestring används.

Andra vanligen använda metoder för att bestämma innehållet lipid i mikroalger inkluderar färgning biomassan med lipofila fluorescerande fläckar såsom Nilen röd eller BODIPY och mätning av fluorescenssignalen ^21,22. En fördel med dessa metoder är att de är mindre arbetskrävande än alternativa metoder. En nackdel med dessa metoder är att den fluorescerande svar är av olika skäl, rörlig mellan species, odlingsförhållanden, lipid klasser och analysmetoder. Som ett exempel, är flera av dessa variationer som orsakas av skillnader i upptag av färgämne genom den mikroalger. Därför behövs Kalibrering med en annan kvantitativ metod, företrädesvis för alla de olika odlingsförhållanden och tillväxtstadier. Slutligen, denna metod inte ger information om fettsyresammansättning och är mindre exakt och reproducerbar än kromatografi baserade metoder.

Denna metod är baserad på den metod som beskrivs av Lamers et al. ²³ och Santos et al. ²⁴ och har även tillämpats av flera andra författare ^1,25-27. Även andra metoder finns tillgängliga som bygger på samma principer och kan ge liknande resultat ^9,28.

Protocol

1. Provberedning Det finns två alternativa protokoll för provberedning ingår i stegen 1,1 och 1,2. Båda metoderna är lika lämpliga och ger liknande resultat, men om en begränsad mängd alger odlingsvolym är tillgänglig, är metoden 1.1 rekommenderas. OBS: För båda protokoll, förbereda två extra pärla visp rör enligt hela protokollet, men utan att lägga alger till dem för att användas som en tomt. På detta sätt kan toppar i GC-kromatogrammet till…

Representative Results

Ett typiskt kromatogram som erhålls genom denna process visas i Figur 1. FAMEs separeras efter storlek och graden av mättnad av GC-kolonnen och protokoll som används. Kortare kedjelängd fettsyror och mer mättade fettsyror (färre dubbelbindningar) har kortare uppehållstider. Den använda GC-kolonn och protokoll har inte för avsikt att separera fettsyraisomerer (samma kedjelängd och mättnadsgrad, men olika positioner av dubbelbindningar), men detta skulle kunna uppnås genom att använda en anna…

Discussion

Den beskrivna metoden kan användas för att bestämma halten liksom sammansättningen av de totala fettsyrorna i alger biomassa. Fettsyror som härrör från alla lipidklasser, inklusive lagring (TAG) liksom membran lipider (fosfolipider och glykolipider), upptäcks. Alla fettsyra kedjelängder och mättnadsgrader som är närvarande i mikroalger kan detekteras och särskiljas. Metoden är baserad på mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till FAMEs, och kvantif…

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25