문화의 세포에 대한 생존 분석 실험
Summary
치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.
Abstract
현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 – 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.
Introduction
생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 "시험관"또는 "문화"로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 – (4,5 – 디메틸 티아 졸 -2 – 일) -2,5 – 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값의 연결을 풀기는 ATP와 MTT 분석이 유일한 생존 분석으로 사용하지 말아야하는 것이 좋습니다. 본 보고서에서는, 세포 구조와 대사 기능을 모두 조사 세 생존 분석은 감당할 수있는 그 자체로 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 뷰에 대해 설명합니다.
우리의 분석의 두 개는 700과 800 nm의 채널에서 형광을 측정하는 적외선 이미 저를 필요로합니다. 잡음은 높은 신호 – 대 – 잡음 비 (3)에 이르는, 적외선 파장에서 낮다. 우리가 사용하는 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위와 16 translatin의 비트 깊이적외선의 2 (16) 또는 65,536 그늘에 g. 이뿐만 아니라, 각각의 파장에 대해 색이 8 또는 256 음영을 수득 8 비트 컬러 이미징, 대조 할 수있다. 따라서, 16 비트 영상은 미세한 해상도를 가지고 있습니다. 원래 적외선 이미지는 종종 프레젠테이션 게시 된 보고서에 (800 NM)과 적색 (700 nm의) 녹색 모조 착색되는 것을 주목해야한다. 오디세이 화상 카메라는 일반적으로 웨스턴 블로 팅과에서 셀 서부 4-7 모두에 사용됩니다. 에서 셀 포름 알데히드 고정 된 세포에 서부는 관심의 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 적외선 형광 보조 항체 차례로 레이블을 지정. 이 기술은 인산화 엔드 포인트 6에 특히 유용한 것으로 알려져있다. 우리의에서 셀 서부에서, 우리는 세포 골격 단백질 α-튜 불린 또는 800 nm의 채널에서 신경 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)에 대한 고정 된 세포를 얼룩. 이들 단백질은 높은 신호 – 대 – 잡음 비를 수득 할 정도로 풍부하다. 우리는 또한 700에있는 우리의 판을 얼룩DRAQ5의 얼룩과 사파이어 얼룩 세포질에 대한 핵에 대한 나노 채널. 세포 골격 단백질과 DRAQ5 + 사파이어 얼룩 두 따라서 세포 구조를 반영합니다.
제 생존력 분석은 대사 기능을 측정하여 호출 "셀 역가 글로."이 루시페라아제 기반 분석에서, 발광 값 ATP 농도에 정비례한다. ATP 분석은 일반적으로 가능한 세포에게 8-12을 정량화하는 데 사용됩니다. 셀 당 ATP 출력 독소 치료의 함수로 변경할 수 있기 때문에, 분석의 이름으로 단어 "역가"를 포함하는 것은 다소 명칭이 잘못된 것입니다 및 휴대폰 번호 8에 비례하므로 항상이다. ATP 농도는 13 시간주기 리듬에 의해 세포 분열 (14) 및 세포 분화 (15)에 의해 영향을받을 수있다. ATP 대사의 강력한 측정하기 때문에 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된 ATP 분석을 수행 간단하고 유용합니다생존 16-21, 자체 수를 셀하지 않을 경우. 서부 따라서 혼자 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 사진을 얻을 수에서 셀 적외선을 보완하기 위해이 분석을 사용하여.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.
Materials
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
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