Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

Summary

Терапевтические соединения часто впервые рассмотрен в пробирке с жизнеспособностью анализов. Слепые количество клеток по человека-наблюдателя может быть очень чувствительны к небольшим изменениям количества клеток, но не оценить функцию. Компьютеризированная жизнеспособности анализы, как описано здесь, может оценить как структуру и функцию на объективной основе.

Abstract

Руководство количества клеток на микроскоп являются чувствительными средством оценки жизнеспособности клеток, но требуют больших затрат времени и, следовательно, дорогой. Компьютеризированная жизнеспособности анализы стоят дорого с точки зрения оборудования, но может быть быстрее и объективнее, чем рассчитывает ручных клеток. В настоящем докладе описывается использование трех таких жизнеспособности анализов. Два из этих анализов инфракрасные и один люминесцентный. Оба инфракрасных анализы полагаться на 16 бит Odyssey Imager. Один инфракрасный анализ использует DRAQ5 пятно для ядер в сочетании с Sapphire пятно для цитозоле и визуализируется в 700 нм канала. Другой инфракрасный анализ, В-Cell Западная, использует антитела против белков цитоскелета (α-тубулина или микротрубочек связаны белка 2) и помечает их в 800 нм канала. Третий жизнеспособность анализ является широко используемым люминесцентные тест для АТФ, но мы используем четверть рекомендованной объема, чтобы сэкономить на стоимости. Эти измерения всех линейных и коррелирует с количеством сеLLS покрытием, но различаются по чувствительности. Все три анализы обойти много времени микроскопии и попробовать весь колодец, тем самым снижая ошибки выборки. Наконец, все анализы легко может быть завершена в течение одного дня в конце эксперимента, что большее количество экспериментов, чтобы быть произведены в короткие сроки. Однако все они опираются на предположение, что число клеток остаются пропорционально уровень сигнала после лечения, в предположении, что иногда не встречал, особенно для сотовой АТФ. Кроме того, если клетки увеличиваются или уменьшаются в размерах после лечения, это может повлиять на уровень сигнала, не влияя количества клеток. Мы пришли к выводу, что все жизнеспособности анализы, в том числе ручных подсчетов, страдают от ряда оговорок, но что компьютеризированные жизнеспособности анализы хорошо стоят первоначальные инвестиции. Используя все три анализы вместе дает полное представление о клеточной структуры и функции.

Introduction

Наиболее распространенным жизнеспособность анализа в области биологических наук включает количество клеток. Об этом свидетельствует анализ лучших (самых последних) 200 публикаций, появившихся в PubMed с любым из ключевых слов "в пробирке" или "культура" на 4/29/2013 и 4/30/2013. Из этих публикаций, 23,5% использовали кол клеток анализы, в том числе ручных подсчетов количества клеток, автоматизированная количество клеток рассчитывает с ПО для обработки изображений, и трипанового синего. Live / Dead анализ использовали в размере 1% от этих публикаций. Число публикаций с использованием МТТ (3 – (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) Анализ метаболического жизнеспособности составил 11%. Этот обзор литературы показывает также, что число публикаций с использованием анализов, таких как МТТ в сочетании с подсчета клеток анализов было только 3,5%. Несмотря тенденция использовать один жизнеспособность анализа само по себе, оценки клеточной функции в сочетании с числа клеток кажется самый лучший выбор для оценки клеточного Integrity. Количество клеток сами по себе не являются достаточными, поскольку остальные клетки не могут быть функциональными или здоровыми, даже если они присутствуют в скважине ^1,2. С другой стороны, функциональные меры, такие как АТФ может увеличиваться или уменьшаться в отсутствие параллельных изменений в количестве клеток. Разобщение метаболических показаний от числа клеток показывает, что АТФ и MTT анализы никогда не должны использоваться в качестве единственного жизнеспособности анализа. В настоящем докладе, три жизнеспособности анализы, что опрос как клеточные структуры и функции обмена веществ описаны, более полное представление о сотовой целостности, чем любой одном анализе сам по себе может позволить.

Двое из наших анализов требуют тепловизорный который измеряет флуоресценцию в нм каналов 700 и 800. Шум является низким в инфракрасном диапазоне, что приводит к более высоким коэффициентом ³ сигнал-шум. Одиссея тепловизор, который мы используем имеет 4,5 журнала динамический диапазон и битовую глубину от 16 translatinг до 2 ¹⁶ или 65536 оттенков ИК-порт. Это можно сравнить с 8-битного цвета изображений, которые только получают 2 ⁸ или 256 оттенков цвета для каждой длины волны. Таким образом, 16-битный изображений имеет более высокое разрешение. Следует отметить, что исходные инфракрасных изображений, часто псевдоцветной зеленый (800 нм) и красный (700 нм) в опубликованных отчетах для представления. Odyssey тепловизоры обычно используются как для вестерн-блоттинга и В-клеточной вестернов ^4-7. В Cell вестерны на формальдегида фиксированной клеток использовать первичных антител против любого интересующего белка и маркировать их, в свою очередь с помощью инфракрасных флуоресцентных вторичными антителами. Этот метод известен быть особенно полезно для фосфорилирования конечными точками ^6. В нашем В-клеточной вестернах, мы пятно фиксированных клеток для белков цитоскелета α-тубулина или нейронов микротрубочек связанных белков 2 (MAP2) в 800 нм канала. Эти белки являются достаточно обильные, получая высокие отношения сигнал-шум. Мы также окрасить наши тарелки в 700нм канал для ядер с DRAQ5 пятно и для цитоплазмы с Sapphire пятно. Оба белков цитоскелета и DRAQ5 + Sapphire пятна, таким образом, отражают клеточные структуры.

Третий жизнеспособность анализе измеряют функцию обмена веществ и называется "Сотовый Титр Glo.« В этом люциферазы основе анализа, значения люминесценции находятся в прямой пропорции к уровня АТФ. ATP анализы обычно используются для количественной оценки жизнеспособных клеток ^8-12. Тем не менее, в том числе слово "титр" во имя анализа является чем-то неправильным, потому что выход АТФ на клетку можете изменить в зависимости от токсина лечения и, следовательно, не всегда пропорционально клеток номер ^8. Уровни АТФ также может зависеть от циркадных ритмов ¹³ и клеточного деления ¹⁴ и дифференцировки клеток ^15. Тем не менее, анализ ATP, показанный здесь, прост в исполнении и полезно, потому что АТФ является надежной мерой метаболическойЖизнеспособность ^16-21, если не сотового телефона по себе. Использование этого теста в дополнение к ИК в ячейке вестерны поэтому дает более полную картину клеточной целостности, чем только какой-либо одной анализа.

Protocol

Схема протоколов проиллюстрировано на Рисунке 1. 1. Сотовый Покрытие Пластина клеток в 96-луночных планшетах при различных плотностях гальванических (рис. 2). Для проверки линейности на N2A клеточной линии нейробластомы, плиты 2.5K, 5к, 10к, и 15k к…

Representative Results

Скорость-ограничивающим фактором в этих экспериментах инфракрасный окрашивание, как анализ АТФ является относительно коротким по продолжительности. Для инфракрасных анализов, мы ожидаем, что восемь 96-луночные планшеты могут быть окрашены и сканируется в течение одного дня по ошелом?…

Discussion

Мы обнаружили, что уровень сигнала во всех трех анализов жизнеспособности является линейной и коррелирует с плотностью нанесения покрытия. Тем не менее, не все анализы одинаково чувствительны к 2 раза или в 1,5 раза изменений плотности покрытия. Для n2a клеток, инфракрасные анализы менее ?…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555