Bärkraft: Analyser för celler i odling

Summary

Terapeutiska föreningar är ofta först undersökas in vitro med lönsamhetsanalyser. Blind celltal av en mänsklig observatör kan vara mycket känsliga för små förändringar i antalet celler men inte bedöma funktion. Datorise viabilitet analyser, som beskrivs här, kan bedöma både struktur och funktion på ett objektivt sätt.

Abstract

Manuella kroppar på ett mikroskop är ett känsligt sätt att bedöma cellulär viabilitet, men är tidskrävande och därför dyra. Datoriselönsamhetsanalyser är dyrt i form av utrustning, men kan vara snabbare och mer objektiv än manuella kroppar. Den här rapporten beskriver användningen av tre sådana lönsamhetsanalyser. Två av dessa analyser är infrarött och en är luminiscerande. Båda IR-analyser är beroende av en 16 bitars Odyssey Imager. En infraröd analys använder DRAQ5 fläcken för kärnor kombinerat med Sapphire fläcken för cytosolen och visualiseras i 700 nm-kanalen. Den andra IR-analysen, en in-Cell Västra använder antikroppar mot cytoskelettproteiner (α-tubulin eller mikrotubuli associerat protein 2) och märker dem i 800 nm-kanalen. Den tredje analys livskraft är en vanligt förekommande självlysande analys för ATP, men vi använder en fjärdedel av den rekommenderade volymen för att spara på kostnader. Dessa mätningar är alla linjära och korrelerar med antalet cells klädd, men varierar i känslighet. Alla tre analyser kringgå tidskrävande mikroskopi och prova hela väl och därmed minska urvalsfel. Slutligen kan alla analyserna lätt vara slutförd inom en dag i slutet av försöket, vilket gör att ett större antal experiment som ska utföras inom korta tidsramar. Men de har alla förlitar sig på antagandet att antalet celler förblir i proportion till signalstyrka efter behandlingar, ett antagande som ibland inte är uppfyllt, i synnerhet för cellulär ATP. Vidare, om celler ökar eller minskar i storlek efter behandling, kan detta påverka signalstyrkan utan att påverka cellantal. Vi drar slutsatsen att alla lönsamhetsanalyser, inklusive manuella räkningar, lider av ett antal förbehåll, men att datoriserade lönsamhetsanalyser är väl värda den ursprungliga investeringen. Använda alla tre analyser tillsammans ger en heltäckande bild av cellstruktur och funktion.

Introduction

Den vanligaste viabilitetsanalys i de biologiska vetenskaperna innebär kroppar. Detta framgår av en analys av de bästa (senaste) 200 publikationer som dök upp i PubMed med något av sökorden "in vitro" eller "kultur" på 2013/04/29 och 2013/04/30. Av dessa publikationer, 23,5% används analyser celltals, inklusive manuella cellnummer räknas, automatiserad cellnummer räknar med bildbehandlingsprogram, och trypanblåttuteslutning. Live / Dead analys användes i en% av dessa publikationer. Det antal publikationer med hjälp av MTT-(3 – (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid)-analysen för metabolisk livsduglighet var 11%. Denna genomgång av litteraturen visar också att antalet publikationer med hjälp analyser såsom MTT tillsammans med celltalsanalyser var endast 3,5%. Trots trenden att använda en livskraft analys av sig själv, bedöma cellulär funktion i kombination med cellnummer verkar det bästa valet för att bedöma cellulära integrity. Celltal i sig själva inte är tillräckliga, eftersom de återstående cellerna inte kan vara funktionell eller friska trots att de är närvarande i väl ^1,2. Omvänt kan funktionella åtgärder såsom ATP ökar eller minskar i avsaknad av parallella förändringar i antalet celler. Den frikoppling av metabola avläsning från antalet celler tyder på att ATP-och MTT-analyser bör aldrig användas som enda livskraft analysen. I denna rapport är tre lönsamhetsanalyser som kart både cellulära strukturer och metabolisk funktion beskrivs, för en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys i sig har råd med.

Två av våra analyser kräver en infraröd kameran som mäter fluorescens i de 700 och 800 nm kanaler. Buller är låg i de infraröda våglängder, vilket leder till högre signal-till-brus-förhållanden ^3. Odyssey Imager som vi använder har en 4,5 log dynamiskt omfång och lite djup av 16, translating till 2 ¹⁶ eller 65.536 nyanser av infrarött. Detta kan ställas i kontrast till 8-bitars färgavbildning, vilket bara ger 2 ⁸ eller 256 färgnyanser för varje våglängd. Därmed har 16-bitars bildbehandling bättre upplösning. Det bör noteras att de ursprungliga värmebilder är ofta pseudocolored grön (800 nm) och röda (700 nm) i publicerade rapporter för presentation. Odyssey kameror används ofta både för Western blotting och I-Cell Westerns ^4-7. I-cell Westerns på formaldehydfixerade celler använder primära antikroppar mot något protein av intresse och märka dem i tur och ordning med infraröd fluorescerande sekundära antikroppar. Denna teknik är känd för att vara särskilt användbart för fosforylering endpoints ^6. I vår I-Cell Westerns, vi färga fixerade celler för cytoskelettproteiner α-tubulin eller neuronala mikrotubuli associerat protein 2 (MAP2) i 800 nm-kanalen. Dessa proteiner är tillräckligt omfattande för att ge en hög signal-till-brus-förhållanden. Vi fläckar också våra tallrikar i 700nm-kanal för kärnor med DRAQ5 fläcken och för cytoplasman med Sapphire fläcken. Både cytoskelettproteiner och DRAQ5 + Sapphire fläckar speglar alltså cellstrukturer.

Den tredje analys livskraft mäter metabolisk funktion och kallas "Cell Titer Glo." I denna luciferas-baserad analys, luminiscens värden är i direkt proportion till ATP-nivåer. ATP-analyser används allmänt för att kvantifiera livskraftiga celler ^8-12. Men även ordet "titer" i namn av analysen är något av en missvisande eftersom ATP produktionen per cell kan förändras som en funktion av toxinbehandlingar och är därför inte alltid i proportion till cell nummer ^8. ATP-nivåer kan också påverkas av dygnsrytmen ¹³ och genom celldelning ¹⁴ och celldifferentiering ^15. Ändå är den ATP-analys visas här enkelt att utföra och användbara eftersom ATP är en robust mått på metabolisklivskraft ^16-21, om inte antalet celler i sig. Med hjälp av denna analys för att komplettera den infraröda I-Cell Westerns ger därför en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys ensam.

Protocol

Ett schema över de protokoll som illustreras i figur 1. 1. Cell Plating Plate celler i 96-brunnsplattor vid olika pläterings densiteter (figur 2). För linjäritet kontroller av N2a neuroblastomcellinje, tallrik 2.5k, 5k, 10k och 15k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. För linjäritet kontroller i råtta primära kortikala neuroner, platta 25k, 50k, 100k och 200k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. Om de cell…

Representative Results

Den hastighetsbegränsande faktorn i dessa experiment är den infraröda färgning, såsom ATP-analysen är relativt kort varaktighet. För IR-analyser, räknar vi med att åtta 96-brunnar kan färgas och skannas inom en dag av svindlande två partier av fyra plattor vardera (se figur 1). Denna bedömning utgår från 20 min för fixering, 30 min av tvätt, 30 min av blockering, 2 tim primär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, 1 tim sekundär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, …

Discussion

Vi har funnit att signalstyrkan i alla tre viabilitet analyser är linjär och korreleras med plätering densitet. Men inte alla de analyser som är lika känslig för två-faldig eller 1,5-faldiga förändringar av plätering densitet. För N2A-celler, de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP-analysen, särskilt vid lägre bordläggningen tätheter. Trots att de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP, den DRAQ5 + Sapphire analyser och α-tubulin analyser är i god överensstämmelse i att de avslö…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555