Levedyktighet Analyser for celler i kultur

Summary

Terapeutiske forbindelser blir ofte først undersøkt in vitro med levedyktighet assays. Blindcelletellingene med en menneskelig observatør kan være meget følsom for små endringer i cellenummer, men ikke vurdere funksjon. Datastyrt levedyktighet analyser, slik det er beskrevet her, kan vurdere både struktur og funksjon på en objektiv måte.

Abstract

Manuelle celletall på et mikroskop er en følsom måte å vurdere cellelevedyktigheten, men er tidskrevende og derfor kostbart. Datastyrt levedyktighet analyser er dyrt i form av utstyr, men kan være raskere og mer objektiv enn manuelle celletall. Den foreliggende rapport beskriver bruken av tre slike levedyktighet assays. To av disse analysene er infrarødt og en er selvlysende. Begge infrarøde analyser stole på en 16 bit Odyssey Imager. En infrarød analysen bruker DRAQ5 flekken for kjerner kombinert med Sapphire flekken for cytosol og er visualisert i 700 nm kanal. Den andre infrarøde analysen, en I-Cell Western, bruker antistoffer mot cytoskeletal proteiner (α-tubulin eller mikrotubulus assosiert protein 2) og skiltene dem i 800 nm kanal. Den tredje levedyktighet analysen er en vanlig selvlysende analysen for ATP, men vi bruker en fjerdedel av det anbefalte volumet for å spare på kostnadene. Disse målingene er alle lineære og korrelerer med antallet cells belagt, men varierer i sensitivitet. Alle tre assays omgå tidkrevende mikroskopi og prøve den hele brønnen, og dermed redusere utvalgsfeil. Endelig alle assays kan lett fullføres i løpet av en dag ved slutten av eksperimentet, slik at et større antall forsøk som skal utføres i løpet av korte tidsrammer. Men alle er avhengige av antagelsen om at celletall forbli i forhold til signalstyrken etter behandlinger, en antagelse som noen ganger ikke er oppfylt, spesielt for mobilnettet ATP. Videre, hvis celler øke eller avta i størrelse etter behandling, kan dette påvirker signalstyrken uten å påvirke cellenummer. Vi konkluderer med at alle levedyktighet analyser, inkludert manuelle tellinger, lider av en rekke advarsler, men at datastyrte levedyktighet analysene er vel verdt den opprinnelige investeringen. Bruke alle tre analysene gir sammen et helhetlig syn på cellestruktur og funksjon.

Introduction

Den vanligste levedyktighet analysen i de biologiske vitenskaper innebærer celletall. Dette er dokumentert av en analyse av de beste (de siste) 200 publikasjoner som dukket opp i PubMed med noen av søkeordene "in vitro" eller "kultur" på 4/29/2013 og 4/30/2013. Av disse publikasjonene, 23,5% brukte celle count analyser, inkludert manuelle mobilnummer teller, teller automatiserte celle nummer med bildebehandlingsprogrammer, og Trypanblå eksklusjon. Live / Døde analysen ble brukt i 1% av disse publikasjonene. Den rekke publikasjoner ved hjelp av MTT (3 – (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay for metabolsk levedyktighet var 11%. Denne undersøkelse av litteraturen viser også at antallet publikasjoner bruke assays slik som MTT i forbindelse med celletall assays var bare 3,5%. Til tross for trenden å bruke en levedyktighet analysen av seg selv, vurdere cellular funksjon i kombinasjon med cellenummer synes det beste valget for å vurdere cellular jegntegrity. Celletellinger av seg selv er ikke tilstrekkelig, fordi de gjenværende celler ikke kan være funksjonelle eller friske selv om de er til stede i brønnen ^1,2. Motsatt kan funksjonelle tiltak som ATP øke eller redusere i fravær av parallelle endringer i antall celler. Den frakopling av metabolske avlesninger fra celle nummer antyder at ATP og MTT-assay aldri skal brukes som eneste levedyktighet assay. I den foreliggende rapporten, er tre levedyktighet analyser som kartlegger både mobil strukturer og metabolsk funksjon beskrevet, for en mer omfattende oversikt over mobilnettet integritet enn noen én analyse av seg selv kan ha råd til.

To av våre analyser krever en infrarød imager som måler fluorescens i de 700 og 800 nm kanaler. Støy er lav i de infrarøde bølgelengder, noe som fører til høyere signal-til-støy-forhold ^tre. The Odyssey imager som vi bruker har en 4,5 log dynamisk område og en bit-dybde på 16, translating til to ¹⁶ eller 65 536 nyanser av infrarød. Dette kan stå i motsetning til 8-bits fargebilder, noe som bare gir 2 ⁸ eller 256 nyanser av farge for hver bølgelengde. Således har 16-bit bilde finere oppløsning. Det bør bemerkes at de originale infrarøde bilder er ofte pseudocolored grønn (800 nm) og rødt (700 nm) i publiserte rapporter for presentasjon. Odyssey kameraer blir ofte brukt både for Western blotting og I-Cell Westerns ^4-7. I-Cell Westerns på formaldehyd faste celler bruker primære antistoffer mot ethvert protein av interesse og merke dem i sving med infrarøde fluorescerende sekundære antistoffer. Denne teknikken er kjent for å være spesielt nyttig for fosforylering endepunkter ^seks. I vår I-Cell Westerns, beis vi faste celler for cytoskeletal proteiner α-tubulin eller nevronale microtubule assosiert protein 2 (MAP2) i 800 nm kanal. Disse proteinene er rikelig nok til å gi høye signal-til-støy-forhold. Vi har også beis våre plater i 700nm kanal for atomkjerner med DRAQ5 flekken og for cytoplasma med Sapphire flekken. Både cytoskeletal proteiner og DRAQ5 + Sapphire flekker dermed reflektere cellulære strukturer.

Den tredje analysen måler levedyktighet metabolsk funksjon, og kalles "Cell Titer Glo." I denne luciferase-baserte assay, luminescens verdier er i direkte forhold til ATP-nivåer. ATP-analyser blir ofte brukt til å kvantifisere levedyktige celler ^8-12. Imidlertid inneholder ordet "titer" i navnet til analysen er misvisende, fordi ATP produksjon per celle kan endres som en funksjon av toksin-behandlinger, og er derfor ikke alltid i forhold til celletallet ^8.. ATP-nivåer kan også bli påvirket av døgnrytme ¹³ og ved celledeling ¹⁴ og celledifferensiering ^15. Ikke desto mindre ATP-analysen er vist her er enkel å utføre og nyttig fordi ATP er en robust mål for metabolsklevedyktighet ^16-21, hvis ikke celle nummer per se. Ved hjelp av denne analysen for å utfylle den infrarøde I-Cell Westerns gir derfor et mer helhetlig bilde av cellulær integritet enn noen én analyse alene.

Protocol

Et skjema av protokollene er illustrert i figur 1.. En. Cell Plating Plate-celler i 96-brønners plater ved forskjellige pletteringstettheter (figur 2). For linearitetskontroll på N2a neuroblastom cellelinje, plate 2.5k, 5k, 10k og 15k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe. For linearitetskontroll hos rotte primære kortikale nevroner, plate 25k, 50k, 100k og 200k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe…

Representative Results

Den hastighetsbegrensende faktor i disse eksperimenter er det infrarøde flekker, som ATP-analysen er relativt korte i varighet. For de infrarøde analyser, forventer vi at åtte 96-brønners plater kan være farget og skannet i løpet av én dag etter svimlende to grupper av fire plater hver (se figur 1). Denne beregningen forutsetter 20 min for fiksering, 30 min for vasking, 30 min for å blokkere, 2 timers primært antistoff, etterfulgt av inkubering i 30 min med vaskinger 1 time sekundært antistoff…

Discussion

Vi har funnet at signalstyrken i alle tre levedyktighet assays er lineær og korrelert med pletteringstetthet. Men ikke alle analysene er like følsom for to-ganger eller 1,5 ganger endringer i pletteringstetthet. For N2A-celler, de infrarøde analyser er mindre følsom enn den ATP-analysen, spesielt ved lavere densiteter plating. Selv om de infrarøde analyser er mindre følsom enn ATP, den DRAQ5 + Sapphire assays og α-tubulin assays er i god overensstemmelse ved at de avslører meget beskyttende virkning av N-acetyl-…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555