Levedygtighed Analyser for celler i kultur

Summary

Terapeutiske forbindelser ofte først undersøgt in vitro med rentabilitet analyser. Blind celletal ved en menneskelig observatør kan være meget følsomme over for små ændringer i celle nummer, men ikke vurdere funktion. Edb levedygtighed assays, som beskrevet her, kan vurdere både struktur og funktion på en objektiv måde.

Abstract

Manuelle celletal på et mikroskop er en følsom middel til at vurdere cellulær levedygtighed, men er tidskrævende og derfor dyrt. Edb levedygtighed assays er dyre i form af udstyr, men kan være hurtigere og mere objektiv end manuelle celletallet. Nærværende rapport beskriver brugen af ​​tre sådanne levedygtighed assays. To af disse assays er infrarød og en er selvlysende. Begge infrarøde analyser stole på en 16 bit Odyssey Imager. En infrarød analyse bruger DRAQ5 pletten for kerner kombineret med Sapphire pletten for cytosol og visualiseres i 700 nm-kanal. Den anden infrarød analyse, en In-Cell Western anvender antistoffer mod cytoskeletale proteiner (α-tubulin eller mikrotubulus-associeret protein 2) og etiketter dem i 800 nm kanal. Den tredje levedygtighedsassay er et almindeligt anvendt selvlysende assay for ATP, men vi bruger en fjerdedel af den anbefalede mængde for at spare på omkostningerne. Disse målinger er alle lineære og korrelerer med antallet af ceLLS forgyldt, men varierer i følsomhed. Alle tre analyser omgå tidskrævende mikroskopi og prøve hele godt, og derved reducere fejlprocenten. Endelig alle analyserne kan nemt være afsluttet inden for en dag i slutningen af ​​forsøget, så et større antal forsøg, der skal udføres inden for korte tidsrammer. Men de alle afhængige af den antagelse, at celleantal forbliver i forhold til signalstyrken efter behandlinger, en antagelse, der undertiden ikke er opfyldt, især for cellulær ATP. Desuden, hvis celler forøge eller formindske i størrelse efter behandling, dette kan påvirke signalstyrken uden at påvirke celle nummer. Vi konkluderer, at alle levedygtighed assays, herunder manuelle optællinger, lider af en række forbehold, men at edb levedygtighed assays er værd den oprindelige investering. Med alle tre analyser sammen giver et samlet overblik over cellulær struktur og funktion.

Introduction

Den mest almindelige levedygtighedsassay i de biologiske videnskaber indebærer celletallet. Dette fremgår af en analyse af de øverste (nyeste) 200 publikationer, der dukkede op i PubMed med enten af nøgleordene "in vitro" eller "kultur" på 2013/04/29 og 2013/04/30. Af disse publikationer, 23,5% anvendes celletalsdata assays, herunder manuelle celle nummer tæller, automatiseret celle nummer tæller med imaging software, og trypanblåteksklusion. Live / Dead assay blev brugt i 1% af disse publikationer. Antallet af publikationer ved hjælp af MTT (3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-assay for metabolisk levedygtighed var 11%. Denne undersøgelse af litteraturen viser også, at antallet af publikationer ved hjælp af assays, såsom MTT, sammenholdt med celletal assays var kun 3,5%. På trods af tendensen til at bruge en levedygtighedsassay af sig selv, vurdere cellulære funktion i kombination med celletal synes det bedste valg til at vurdere cellulær jegntegrity. Celletællinger i sig selv ikke er tilstrækkelig, da de resterende celler ikke kan være funktionel eller raske, selvom de er til stede i brønden ^1,2. Omvendt kan funktionelle foranstaltninger såsom ATP forøge eller formindske i mangel af parallelle ændringer i antallet af celler. Den afkobling af metaboliske udlæsninger fra celle nummer tyder på, at ATP og MTT-assays aldrig bør anvendes som den eneste levedygtighedsassay. I nærværende rapport er der tre levedygtighed assays denne undersøgelse både cellulære strukturer og stofskiftet beskrevet, for en mere omfattende billede af cellulær integritet end nogen analyse af sig selv har råd til.

To af vores analyser kræver en infrarød kamera, der måler fluorescens i de 700 og 800 nm kanaler. Støj er lav i de infrarøde bølgelængder, hvilket fører til højere signal-til-støj-forhold ^3. Odyssey imager, som vi bruger, har en 4,5 log dynamikområde og en bit-dybde på 16, translating til 2 ¹⁶ eller 65.536 nuancer af infrarød. Dette kan sammenholdes med 8-bit farve billedbehandling, som kun giver 2 ⁸ eller 256 nuancer af farve for hver bølgelængde. Således, 16-bit billedbehandling har finere opløsning. Det skal bemærkes, at de oprindelige infrarøde billeder ofte pseudocolored grøn (800 nm) og rød (700 nm) i offentliggjorte rapporter for præsentation. Odyssey kameraer er almindeligt anvendt til både Western blotting og In-Cell Westerns ^4-7. In-Cell Westerns på formaldehydfikserede celler bruger primære antistoffer mod ethvert protein af interesse og mærke dem til gengæld med infrarøde fluorescerende sekundære antistoffer. Denne teknik er kendt for at være særligt anvendelige til fosforylering endepunkter ^6. I vores In-Cell Westerns, vi pletten faste celler til cytoskeletproteiner α-tubulin eller neuronal mikrotubuli associeret protein 2 (MAP2) i 800 nm-kanal. Disse proteiner er rigelige nok til at give høje signal-til-støj forhold. Vi plette også vores plader i 700nm kanal for kerner med DRAQ5 pletten og for cytoplasma med Sapphire pletten. Både cytoskeletproteiner og DRAQ5 + Sapphire pletter afspejler således cellulære strukturer.

Den tredje levedygtighedsassay måler metaboliske funktion og kaldes "Cell Titer Glo." I denne luciferase assay, luminescens værdier er i direkte forhold til ATP-niveauer. ATP assays er almindeligt anvendt til at kvantificere levedygtige celler ^8-12. Imidlertid indeholder ordet "titer" i navnet af assayet er noget af en misvisende, fordi ATP produktion pr celle kan ændre sig som en funktion af toksin behandlinger, og er derfor ikke altid i forhold til celleantal ^8. ATP niveauer kan også blive påvirket af døgnrytmen ¹³ og ved celledeling ¹⁴ og celledifferentiering ^15. Alligevel ATP assay vist her, er enkel at udføre og nyttig, fordi ATP er en robust mål for metabolisklevedygtighed ^16-21, hvis ikke celletal per se. Ved hjælp af denne analyse til at supplere den infrarøde In-Cell Westerns giver derfor et mere omfattende billede af cellulær integritet end nogen assay alene.

Protocol

En skematisk af de protokoller, der er illustreret i figur 1.. 1.. Celleudpladning Plate celler i 96-brønds plader ved forskellige plating tætheder (figur 2). For linearitetschecks på n2a neuroblastomcellelinie, plade 2.5k, 5k, 10k, og 15k brønd i 3 eller 6 brønde / gruppe. For linearitetschecks i rotte primære kortikale neuroner, plade 25k, 50k, 100k og 200k brønd i 3 eller 6 brønde / gruppe. Hvis cellelinjer eller primær…

Representative Results

Den hastighedsbegrænsende faktor i disse eksperimenter er den infrarøde farvning, som ATP-assayet er forholdsvis kort varighed. For de infrarøde assays forventer vi, at otte plader med 96 brønde kan farves og scannes inden for én dag ved en gradvis to partier af fire plader hver (se figur 1). Dette skøn forudsætter 20 min af fiksering, 30 min vask, 30 min af blokering, 2 hr primære antistof inkubation efterfulgt af 30 min vask, 1 time sekundært antistof inkubation efterfulgt af 30 min vask, 30 …

Discussion

Vi har fundet, at signalstyrken i alle tre levedygtighed assays er lineær og korreleret med udpladningsdensitet. Men ikke alle assays er lige følsomme over for 2-fold eller 1,5-fold ændring i udpladningsdensitet. For N2A celler, infrarøde assays er mindre følsomme end ATP-assay, især ved lavere plating tætheder. Selvom de infrarøde assays er mindre følsomme end ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays og de α-tubulin assays er i god overensstemmelse med, at de afslører meget beskyttende virkning af N-acetylcystein. De…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555