Les analyses de viabilité de cellules en culture

Summary

Les composés thérapeutiques sont souvent d'abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d'une manière objective.

Abstract

Le nombre de cellules manuelles sur un microscope sont des moyens sensibles à l'évaluation de la viabilité cellulaire, mais prennent du temps et par conséquent coûteux. Essais de viabilité informatiques sont coûteux en termes d'équipement, mais peut être plus rapide et plus objective que les comptages manuels cellulaires. Le présent rapport décrit l'utilisation de ces trois essais de viabilité. Deux de ces dosages sont l'infrarouge et l'autre est luminescent. Les deux tests infrarouges reposent sur un imageur 16 bits Odyssey. Une analyse infrarouge utilise la tache de DRAQ5 pour les noyaux combinés avec la tache de Sapphire pour cytosol et est visualisé dans le canal 700 nm. L'autre test infrarouge, un In-Cell occidentale, utilise des anticorps contre les protéines du cytosquelette (α-tubuline ou microtubules protéines associées 2) et les étiquettes dans le canal 800 nm. Le troisième test de viabilité est un dosage luminescent couramment utilisé pour l'ATP, mais nous utilisons un quart de la quantité recommandée pour économiser sur les coûts. Ces mesures sont toutes linéaires et sont en corrélation avec le nombre de CElls plaqué, mais varient en sensibilité. Tous les trois essais contourner microscopie temps et déguster l'ensemble bien, ce qui réduit l'erreur d'échantillonnage. Enfin, tous les tests peuvent facilement être achevée dans un délai d'une journée de la fin de l'expérience, ce qui permet un plus grand nombre d'expériences à réaliser dans des délais courts. Cependant, elles reposent toutes sur l'hypothèse que le nombre de cellules restent en proportion de la force du signal après les traitements, une hypothèse qui est parfois pas satisfaite, en particulier pour l'ATP cellulaire. En outre, si les cellules augmentent ou diminuent en taille après le traitement, cela pourrait affecter la force du signal sans affecter le nombre de cellules. Nous concluons que tous les tests de viabilité, y compris les comptages manuels, souffrent d'un certain nombre de réserves, mais que les essais de viabilité informatisés valent bien l'investissement initial. En utilisant les trois dosages donne ainsi une vue d'ensemble de la structure et de la fonction cellulaire.

Introduction

Le test de viabilité la plus courante dans les sciences biologiques implique nombre de cellules. Ceci est démontré par une analyse des meilleurs (les plus récents) de 200 publications parues dans PubMed avec l'un des mots-clés «in vitro» ou «culture» sur 29/04/2013 et 30/04/2013. Parmi ces publications, 23,5% utilisés essais de comptage de cellules, y compris les manuels nombre de cellules chiffres, le nombre de cellules automatisé compte avec un logiciel d'imagerie, et exclusion au bleu Trypan. Le dosage Vivant / Mort a été utilisé dans 1% de ces publications. Le nombre de publications utilisant le MTT (3 – (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl) test pour la viabilité métabolique était de 11%. Cette revue de la littérature montre également que le nombre de publications en utilisant des tests tels que MTT en conjonction avec les tests de comptage cellulaire n'était que de 3,5%. Malgré la tendance à utiliser un test de viabilité par lui-même, l'évaluation de la fonction cellulaire en combinaison avec le nombre de cellules semble le meilleur choix pour l'évaluation i cellulaireNtegrity. Les comptages cellulaires par eux-mêmes ne sont pas suffisants parce que les cellules restantes ne peuvent pas être fonctionnel ou en bonne santé, même si elles sont présentes dans le puits ^{de 1,2.} A l'inverse, les mesures fonctionnelles telles que l'ATP peut augmenter ou diminuer en l'absence de changements parallèles dans le nombre de cellules. Le découplage de lectures métaboliques du nombre de cellules suggère que l'ATP et MTT essais ne doivent jamais être utilisés comme seul test de viabilité. Dans le présent rapport, trois essais de viabilité, qui sondent les structures cellulaires et la fonction métabolique sont décrits, pour une vision plus globale de l'intégrité cellulaire que n'importe quel test en lui-même ne peut se permettre.

Deux de nos tests nécessitent un imageur infrarouge qui mesure la fluorescence dans les canaux 700 et 800 nm. Le bruit est faible dans les longueurs d'onde infrarouges, entraînant une hausse des signal-bruit ratios ^3. L'imageur de l'Odyssée que nous utilisons a une gamme dynamique de 4,5 log et une profondeur de bits de 16, Translating à 2 ¹⁶ ou 65 536 nuances de l'infrarouge. Cela peut être comparé à l'imagerie de couleur 8 bits, qui ne donne 2 ⁸ ou 256 nuances de couleur pour chaque longueur d'onde. Ainsi, l'imagerie 16 bits a une résolution plus fine. Il convient de noter que les images infrarouges d'origine sont souvent pseudocolored vert (800 nm) et le rouge (700 nm) dans des rapports publiés pour la présentation. imageurs Odyssey sont couramment utilisés à la fois pour Western blot et In-Cell Westerns ^4-7. In-Cell Westerns sur les cellules fixées au formaldehyde utilisent des anticorps primaires contre toute protéine d'intérêt et de les étiqueter à son tour avec des anticorps secondaires fluorescents infrarouges. Cette technique est connue pour être particulièrement utile pour les points d'extrémité de phosphorylation ^6. Dans notre In-Cell Westerns, nous colorer les cellules fixes de protéines du cytosquelette α-tubuline ou aux microtubules neuronaux de la protéine associée à 2 (MAP2) dans le canal de 800 nm. Ces protéines sont assez abondantes pour donner rapports signal sur bruit. Nous tachons également nos assiettes dans le 700canal nm pour les noyaux avec la tache de DRAQ5 et pour le cytoplasme avec la tache de Sapphire. Tant les protéines du cytosquelette et les DRAQ5 + taches Sapphire reflètent donc des structures cellulaires.

Le troisième test de viabilité de mesurer la fonction métabolique et est appelé "Cell Titer Glo." Pour ce dosage à base de luciférase-, valeurs de luminescence sont en proportion directe avec les taux d'ATP. Essais ATP sont couramment utilisés pour quantifier les cellules viables ^8-12. Cependant, y compris le mot «titre» dans le nom de l'analyse est un peu un abus de langage car la production d'ATP par cellule peut changer en fonction des traitements de toxine et n'est donc pas toujours en proportion du nombre de cellules ^8. Les niveaux d'ATP peuvent également être affectés par les rythmes circadiens ¹³ et par la division cellulaire ¹⁴ et la différenciation des cellules ^15. Néanmoins, le dosage de l'ATP montré ici est simple à réaliser et utile car l'ATP est une mesure robuste métaboliqueviabilité ^16-21, sinon la cellule numéro en soi. L'utilisation de ce test pour compléter l'infrarouge In-Cell Westerns cède donc une image plus complète de l'intégrité cellulaire que tout un test seul.

Protocol

Un schéma des protocoles est illustré sur la figure 1. Une. Cellule de placage Cellules de la plaque dans des plaques à 96 puits à des densités différentes de placage (Figure 2). Pour les contrôles de linéarité sur la ligne N2a de cellules de neuroblastome, plaque 2.5k, 5k, 10k, 15k et cellules par puits dans 3 ou 6 puits / groupe. Pour les contrôles de linéarité dans les neurones corticaux de rat primaires, plaque 25k,…

Representative Results

Le facteur limitant la vitesse dans ces expériences est la coloration de l'infrarouge, comme le dosage de l'ATP est relativement courte en durée. Pour les tests infrarouges, nous prévoyons que huit plaques à 96 puits peuvent être colorés et analysés dans un jour par échelonnement deux lots de quatre assiettes maximum (voir la figure 1). Cette estimation suppose 20 min de fixation, 30 min de lavage, 30 min de blocage, 2 h primaire incubation d'anticorps puis 30 min de lavages, 1 heure…

Discussion

Nous avons trouvé que la puissance du signal dans les trois essais de viabilité est linéaire et en corrélation avec la densité de placage. Cependant, tous les tests sont également sensibles à 2 fois ou 1,5 fois les changements dans la densité de placage. Pour les cellules N2a, les analyses infrarouges sont moins sensibles que le dosage de l'ATP, en particulier à des densités de plaquage inférieure. Bien que les analyses infrarouges sont moins sensibles que l'ATP, les DRAQ5 + Sapphire tests et les essa…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555