מבחני כדאיות לתאים בתרבית
Summary
תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.
Abstract
ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו"ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.
Introduction
Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח "במבחנה" או "תרבות" ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 – (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק .3.5%. למרות המגמה להשתמש assay כדאיות אחד בפני עצמו, הערכת תפקוד תאי בשילוב עם מספר תא נראית הבחירה הטובה ביותר להערכתי סלולריתntegrity. ספירת תאים על ידי עצמם אינן מספיקות, כי התאים שנותרו לא יכולים להיות פונקציונליים או בריאים, למרות שהם נמצאים בבאר 1,2. לעומת זאת, אמצעי פונקציונלי, כגון ATP עשוי להגדיל או להקטין בהיעדר שינויים מקבילים במספר התאים. שחרר את הסוגר של צגי בקרת חילוף חומרים ממספר התא עולה כי אף פעם לא צריכים לשמש מבחני ה-ATP וMTT כassay הכדאיות הבלעדי. בדו"ח הנוכחי, שלושה מבחני כדאיות שיסקרו שני מבנים תאיים ותפקוד מטבולים מתוארים, לתמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בפני עצמו יכול להרשות לעצמו.
שניים מהמבחנים שלנו דורשים תרמי אינפרא אדום שמודדת הקרינה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. רעש הוא נמוך באורכי הגל אינפרא אדום, מה שמוביל ליחסי אות לרעש גבוהים יותר 3. תרמי אודיסיאה שאנחנו משתמשים יש טווח דינמי 4.5 יומן וקצת מעמיקה של 16, translatinגרם ל2 16 או 65,536 גוונים של אינפרא אדום. זה יכול להיות בניגוד להדמיה בצבע של 8 ביט, אשר רק מאפשרת 2 8 או 256 גוונים של צבע לכל אורך גל. לפיכך, יש הדמיה 16 סיביות רזולוציה עדינה. יש לציין שהתמונות אינפרא אדומות המקוריות לעתים קרובות pseudocolored ירוק (800 ננומטר) ואדום (700 ננומטר) בדוחות שפורסמו למצגת. הדמית אודיסיאה משמשות בדרך כלל גם למערבי סופג ובתוך תא המערבונים 4-7. ב- Cell מערבונים על תאים קבוע פורמלדהיד להשתמש נוגדנים ראשוניים כנגד כל חלבון של עניין ולתייג אותם בתורו עם נוגדנים משני ניאון אינפרא אדום. טכניקה זו ידועה להיות שימושי במיוחד עבור נקודות קצה זירחון 6. ב- Cell המערבונים שלנו, אנחנו להכתים תאים קבועים לחלבוני cytoskeletal α-טובולין או microtubule העצבי החלבון קשור 2 (MAP2) בערוץ 800 ננומטר. חלבונים אלה נמצאים בשפע מספיק כדי להניב יחס אות לרעש גבוה. אנחנו גם להכתים הצלחות שלנו ב700ערוץ ננומטר לגרעינים עם כתם DRAQ5 ולציטופלסמה עם כתם ספיר. שני חלבוני cytoskeletal וDRAQ5 + כתמי ספיר ובכך משקפים את המבנים הסלולר.
Assay הכדאיות השלישי מודד תפקוד מטבולים והוא נקרא "תא כייל Glo". ב assay מבוסס לוציפראז זה, ערכי הארה הם ביחס ישירים לרמות ה-ATP. מבחני ה-ATP משמשים בדרך כלל כדי לכמת תאי קיימא 8-12. עם זאת, כולל את המילה "כייל" בשמו של assay הוא קצת מטעה, כי פלט ה-ATP לכל תא יכול להשתנות כפונקציה של טיפולי רעל ולכן הוא לא תמיד באופן יחסי לתא מספר 8. יכולות גם להיות מושפעות רמות ה-ATP על ידי מקצבי היממה 13 ועל ידי חלוקת תא ותא 14 בידול 15. אף על פי כן, assay-ATP שמוצג כאן הוא פשוט לביצוע ושימושי כי ה-ATP הוא מדד חזק של חילוף חומריםכדאיות 16-21, אם לא מספר סלולרי כשלעצמה. שימוש assay זה כדי להשלים את האינפרא אדום ב- Cell מערבונים לכן מניב תמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בלבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים Juliann Jaumotte לרעיון של שמירה על הכרכים של חומרים כימיים בassay-ATP. אנחנו אסירי תודה לתמיכה ניהולית המעולה של מרי קארוזו, דב ווילסון וג'קי Farrer ולבית הספר לרוקחות Mylan למתן תמיכה כספית למחקרים אלו. תודה גם למחלות Hunkele המפחיד הקרן ופרקינסון והפרעות תנועת קרן לתמיכה הכספית שלהם מהמחקרים עצביים העיקריים.
Materials
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
- Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
- Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
- Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
- Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
- Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
- Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? . Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
- Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
- Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
- Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
- Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality–a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
- Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
- Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
- Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
- Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
- Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
- Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
- Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.. PLoS One. 6, (2011).
- Bayer, S. A., Altman, J. . Neocortical Development. , (1991).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
- Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
- Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
- Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
- Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
- Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer’s Disease.. Neural Plast. 2010, (2010).
- Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
- Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer’s disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
- Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer’s dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
- Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
- Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
- Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
- Mattson, M. P. Hormesis defined. . Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. . Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
- McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
- Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
- Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson’s disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
- Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
- Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).
