Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller
Summary
Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.
Abstract
Bir mikroskop Manual hücre sayımları hücre canlılığının değerlendirilmesinde hassas bir yoludur, ancak zaman alıcı ve bu nedenle pahalıdır. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri ekipman açısından pahalı ama daha hızlı ve daha objektif manuel hücre sayımları daha olabilir. Bu rapor, bu tür üç canlılığı tahlillerin kullanımını tarif eder. Bu tahlillerin ikisi kızılötesi ve bir parlak olan. Her iki kızılötesi tahlilleri bir 16 bit Odyssey Imager güveniyor. Bir kızılötesi deney sitosol için safir leke ile kombine çekirdekleri için DRAQ5 leke kullanır ve 700 nm kanalında görüntülenmiştir. Diğer kızılötesi deney, bir In-Cell Western, sitoskeletal proteinler (α-tubulin veya mikrotübül ilişkili protein 2) karşı antikorlar kullanır ve 800 nm kanal bunları etiketler. Üçüncü canlılık deneyi ATP için yaygın olarak kullanılan bir ışıldayan deney, ama biz maliyet tasarruf için önerilen hacminin dörtte kullanın. Bu ölçümler her doğrusaldır ve ce sayısı ile ilişkiliLLS kaplama, ancak duyarlılık değişir. Tüm deneyler üç zaman alıcı mikroskobu aşmak ve tüm kaynak örnek, bu şekilde, örnekleme hatasının azaltılması. Son olarak, bütün deneylerde kolayca kısa zaman dilimleri içinde yapılması gereken deney daha fazla sayıda izin veren, deney sonunda bir gün içinde tamamlanabilir. Ancak, hepsi hücre sayıları tedaviler, bazen özellikle hücresel ATP için bir araya geldi değil, bir varsayım sonra sinyal gücü orantılı kalması varsayımına dayanmasıdır. Hücreler artırmak veya tedavi sonrası boyutunda azalma Ayrıca, eğer, bu hücre sayısı etkilemeden sinyal gücünü etkileyebilir. Biz manuel sayıları dahil tüm canlılığı deneyleri, uyarılar bir dizi muzdarip olduğu sonucuna, ancak bilgisayarlı canlılığı deneyleri ilk yatırım değer. Her üç deneyleri kullanılarak birlikte hücresel yapısı ve fonksiyonu kapsamlı bir görünümünü verir.
Introduction
Biyolojik bilimlerde en yaygın canlılığı tahlil hücre sayıları içerir. Bu 2013/04/29 ve 2013/04/30 üzerinde anahtar kelime ya "in vitro" veya "kültür" ile PubMed'de çıktı üst (en son) 200 yayınların analizi ile kanıtlanır. Bu yayınların, manuel hücre sayısı sayımı dahil olmak üzere% 23.5 kullanılan hücre sayımı tahlilleri, otomatik hücre sayısı görüntüleme yazılımı ile sayar ve Trypan mavi dışlama. Canlı / Ölü deney, bu yayınların% 1 kullanılmıştır. MTT (3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) kullanılarak yayın sayısı metabolik canlılığı için tahlil% 11 idi. Edebiyat Bu anket aynı zamanda hücre sayımı tahlilleri ile birlikte böyle MTT gibi analizleri kullanılarak yayın sayısı sadece% 3.5 olduğunu göstermektedir. Hücre sayısı ile birlikte hücresel fonksiyonunun değerlendirilmesinde, tek başına bir canlılık deneyi kullanmak için eğilim hücresel i değerlendirmek için iyi bir seçim gibi görünüyor rağmenntegrity. Geriye kalan hücreler fonksiyonel ya da 1,2 kuyu içinde mevcut olmasına rağmen sağlıklı olmayabilir, çünkü kendi başına hücre sayımları yeterli değildir. Bunun tersine, ATP gibi fonksiyonel önlemler artırmak veya hücre sayısındaki paralel değişikliklerle yokluğunda azaltabilir. Hücre sayısı metabolik okumalanna ayrılması ATP ve MTT testleri tek canlılık deneyi olarak asla kullanılmamalıdır gerektiğini göstermektedir. Bu raporda, hücresel yapılar ve metabolik fonksiyonu hem de anket üç canlılığı deneyleri gelemez kendisi tarafından herhangi bir tahlil daha hücresel bütünlüğü daha kapsamlı bir görünüm için, tarif edilmektedir.
Bizim deneylerinin iki 700 ve 800 nm kanallarda floresan ölçen bir enfraruj görüntüleyici gerektirir. Gürültü daha yüksek sinyal-gürültü oranı 3 yol açan, kızılötesi dalga boyu düşüktür. Kullandığımız Odyssey kamera, 4.5 günlük dinamik aralık ve 16, TRANSLATIN bir bit derinliğe sahipkızılötesi 2 16 veya 65.536 tonları g. Bu sadece her dalga boyu için renk 2 8 veya 256 tonunu tanıyor 8-bit renk görüntüleme, tezat olabilir. Böylece, 16-bit görüntüleme ince çözünürlüğe sahiptir. Bu orijinal kızılötesi genellikle görsel sunumu için yayınlanmış olan raporlarda (800 nm) ve kırmızı (700 nm), yeşil yalancı olduğu not edilmelidir. Odyssey kameralar genellikle Western blot ve In-Hücre Batılıların 4-7 hem de kullanılmaktadır. In-Cell formaldehit sabit hücreleri üzerinde Western ilgi duyulan herhangi bir protein karşı birincil antikor kullanımı ve kızıl ötesi floresan ikincil antikorlarla da etiketleyin. Bu teknik, fosforilasyon uç noktalar 6 için özellikle yararlı olduğu da bilinmektedir. Bizim In-Cell Western olarak, sitoskeletal proteinler α-tübülin ya da 800 nm kanalda nöronal mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) için sabit hücreleri boyamak. Bu proteinler yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için yeteri kadar bol miktarda bulunmaktadır. Biz de 700 yılında bizim plakaları lekeDRAQ5 leke ile ve safir leke ile sitoplazmada için çekirdekleri için nm kanalı. Sitoskeletal proteinler ve DRAQ5 + Sapphire lekeleri Hem böylece hücresel yapılarını yansıtmaktadır.
Üçüncü canlılığı deneyi, metabolik fonksiyonu büyüklüğüne ve adı "Hücre Titer Glo.", Bu lusiferaz bazlı tahlilde, parlaklık değerleri ATP seviyeleri doğrudan orantılıdır. ATP tahliller genel olarak canlı hücreler 8-12 ölçmek için kullanılır. Hücre başına ATP çıkış toksin tedaviler bir fonksiyonu olarak değişebilir Ancak, tahlilin adına kelime "titre" da dahil olmak üzere bir yanlış isim biraz ve hücre sayısı 8 ile orantılı olarak, bu nedenle her zaman değil. ATP düzeyleri de sirkadyan ritim 13 ve 14, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması 15 etkilenebilir. ATP metabolik sağlam bir ölçüsüdür çünkü Bununla birlikte, burada gösterilen ATP deneyi gerçekleştirmek için basit ve faydalıdırcanlılığı 16-21, başına numara hücre değilse. Batılıların bu nedenle tek başına herhangi bir deneyde daha hücresel bütünlüğün daha kapsamlı bir resmini verir In-Cell kızılötesi tamamlamak için bu tahlil kullanma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm üç canlılığı deneylerde sinyal gücü, doğrusal ve kaplama yoğunluğu ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Ancak, tüm deneyler, 2-kat veya kaplama yoğunluğu 1.5 kat değişikliklere karşı eşit ölçüde hassastır. N2a hücreleri için, kızılötesi deneyler özellikle düşük kaplama yoğunluklarında, ATP deneyi daha az duyarlıdır. Kızılötesi deneyler ATP daha az duyarlı olan, ancak DRAQ5 + Safir deneyler ve α-tubulin deneyleri ki bunlar, N-asetil sistein ve yüksek ölçüde koruyucu bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz ATP deneyinde reaktiflerin hacimleri üzerindeki tasarruf fikri Juliann Jaumotte kabul. Biz bu çalışmalar için mali destek sağlayan Mary Caruso, Deb Willson ve Jackie Farrer ve Eczacılık Mylan Okulu muhteşem idari destek için gönülden teşekkür ederiz. Teşekkür de Hunkele korkunç Hastalıkları Vakfı ve Parkinson ve Hareket Bozuklukları birincil nöronal çalışmaların mali destek Vakfı kaynaklanmaktadır.
Materials
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
- Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
- Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
- Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
- Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
- Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
- Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? . Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
- Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
- Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
- Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
- Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality–a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
- Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
- Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
- Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
- Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
- Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
- Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
- Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.. PLoS One. 6, (2011).
- Bayer, S. A., Altman, J. . Neocortical Development. , (1991).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
- Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
- Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
- Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
- Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
- Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer’s Disease.. Neural Plast. 2010, (2010).
- Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
- Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer’s disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
- Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer’s dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
- Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
- Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
- Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
- Mattson, M. P. Hormesis defined. . Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. . Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
- McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
- Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
- Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson’s disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
- Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
- Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).
