FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi
Summary
Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik teknikleri ters.
Abstract
Arenavirus ters genetik geliştirilmesi ve uygulanması arenavirus alanında 4 önemli bir atılım temsil eder. Genomları içinde önceden belirlenmiş mutasyonlar ile rekombinant bulaşıcı arenaviruses oluşturmak için yeteneği ile birlikte hücre tabanlı arenavirus Minigenom sistemlerinin kullanılması arenavirus yaşam döngüsünün farklı adımlar viral belirleyici katkısı araştırılması, hem de virüs-konak kolaylaştırmıştır etkileşimleri ve arenavirus patogenezi 1, 3, 11 mekanizmaları. Buna ek olarak, trisegmented arenaviruses geliştirilmesi ve böylece arenavirus bazlı aşı vektörü uygulamaları 5 olasılığını açılması, ilgi ek yabancı genleri ifade etmek için arenavirus genomunun kullanımına izin verdi. Aynı şekilde, ifade muhabiri genlerin yeteneğine sahip tek döngüsü bulaşıcı arenaviruses geliştirilmesi highl ilgili araştırma güvenliğini artırmak için yeni bir deneysel araç sağlary patojenik insan arenaviruses 16. Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi bugüne kadar Gıda ve İlaç İdaresi geliştirme (FDA) lisanslı aşı veya aşı vektörleri için bazı engeller teşkil 7,19 kemirgen hücre hatlarının kullanımı, güvendi. Bu engeli aşmak için, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenaviruses etkin bir şekilde nesil burada açıklamak.
Introduction
Arenaviruses Arenaviridae ailesine ait bir bisegmented, negatif dallı RNA genomu 3 zarflı virüslerdir. Arenavirus genomu iki ayrı segmentleri viral 3 bir ambisense şekilde dört protein kodlar. Büyük (L) segmenti RNA-bağımlı RNA polimeraz (L) ve virüs tomurcuklanan temel itici güç olarak hizmet veren küçük HALKA (Gerçekten İlginç Yeni Gen) parmak protein (Z) kodlar. Küçük (S) kademeli bir viral nükleoprotein (NP) ve yüzey glikoprotein (GP) (Şekil 1) kodlar.
Arenaviridae ailesinin bazı üyeleri insanlarda 3 ölümcül kanamalı ateşi (HF) sorumludur. Ilke endişeleri yatan hastalarda 8, 9 yüksek mortalite neden olduğu bilinmektedir Lassa virüsü (LASV) ve Junín virüsü (JUNV) vardır. Bu virüsler sırasıyla Batı Afrika ve kırsal Arjantin, endemik olmasına rağmen,artan seyahat 10 nedeniyle endemik olmayan bölgelere LASV ve JUNV ithalatı artan endişeler vardır. Normal insanlarda ciddi hastalığı ile ilişkili olmasa da, ayrıca, prototipik arenavirus lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) immün sistemi baskılanmış hastalarda 6, 15 ölümcül enfeksiyon vakası olduğu gibi bir ihmal patojen olarak kabul edilir ve konjenital doğum kusurları ve spontan düşükler için sorumludur hamile kadınlar 2, 13. Şu anda herhangi bir ABD arenaviruses ve tedavi karşı aşı sadece kısmen etkilidir ve genellikle önemli yan etkileri ile ilişkili nükleosit analoğu ribavirin ile sınırlıdır FDA tarafından onaylanmıştır.
Plazmid tabanlı ters genetik 4 ve rekombinant arenaviruses 7, 19 nesil tanıtımı büyük ölçüde arenavirus araştırma alanında gelişmiş var. Şu anda, kemirgen hücreleri (BHK-21 gibi) homo için kullanılırS ve L bölümlerinin başlangıç transkripsiyonunu yönlendiren türe özgü murin RNA polimeraz I (pol I) promotöre bağlı yeniden birleştirici arenaviruses arasında tirme. BHK-21 hücreleri Bununla birlikte virüs kurtarma potansiyel bir aşı adayı olarak tohum arenaviruses rekombinant üretimi için onaylanmış bir yöntem değildir. Burada prototipik Eski Dünya (OW) LCMV ve Yeni Dünya (KB) Vero hücrelerinde JUNV Candid içerisinde 1. gerginlik etkin kurtarma için insan pol-I organizatörü kullanımını belgeledi. Benzer bir metodoloji kullanarak, rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve Candid 1. (r3Candid # 1) iki farklı S RNA segmentlerinde 5 olarak kodlanmış iki ek yabancı genleri içeren arenaviruses oluşturulur. Bu yeni sistem son derece tekrarlanabilir ve basit bir protokol takip ama hemen potansiyel aşı veya aşı vektör tohum olarak rekombinant arenaviruses üretimi uygulanabilir değil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi arenavirus biyoloji birçok farklı yönleriyle araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. Burada arenavirus yaparak mevcut sistem için çok önemli bir gelişmeyi belgelemek diğer bulaşıcı hastalıklara karşı arenaviruses ve aşı vektörler karşı FDA onaylı aşı adayların potansiyel üretimi için izin, Vero hücrelerinde kurtarır.
Ilgili deneysel p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz arenavirus ters genetik teknikleri ve plazmid geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için JCT ve LM-S laboratuvarlarında geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. Ayrıca teknik destek için Snezhana Dimitrova teşekkür ederim. JUNV NP (SA02-BG12) yönelik monoklonal antikor BEI Kaynakları (NIAID biyosavunma ve Ortaya Çıkan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu) elde edilmiştir. BYHC Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü Grant sayısı GM068411 tarafından desteklenmiştir. EO-R Fulbright-Conicyt (BIO 2008) ve Rochester Aşı Bursu (2012) almıştır. EO-R güncel destek Rochester Üniversitesi'nde Öğretim Üyesi Yetiştirme ve Çeşitlilik için Office Çeşitlilik ve Akademik Mükemmellik için doktora sonrası Bursu tarafından sağlanmaktadır. LM-S laboratuvar araştırma NIH hibe RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID Merkezleri (HHSN266200700008C) tarafından finanse edilen ve birBiyosavunma Bağışıklık Modelleme (HHSN272201000055C) için Rochester Merkezi Üniversitesi.
JCT laboratuvar Araştırma hibe RO1 AI047140, NIH RO1 AI077719 ve RO1 AI079665 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
