Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d'Innate Immune Health chez le poisson zèbre

Résumé

La réponse immunitaire innée protège contre l'infection par des organismes pathogènes. Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée, l'explosion respiratoire des phagocytes, génère des espèces réactives de l'oxygène qui tuent les micro-organismes envahisseurs. Nous décrivons un essai de stimulation du métabolisme oxydatif qui quantifie les espèces réactives de l'oxygène produites lors de la réponse immunitaire innée est chimiquement induite.

Résumé

La stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes fait partie de la réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes et implique la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). ROS sont toxiques et fonctionne pour tuer les microorganismes phagocytées. Dans quantification in vivo de phagocyte dérivés ROS fournit des informations sur la capacité de l'organisme à une réponse immunitaire innée robuste. Ici, nous décrivons un protocole pour quantifier et comparer ROS dans embryons de poissons zèbres entiers lors de l'induction chimique de l'explosion respiratoire phagocytaire. Ce procédé fait usage d'un composé non fluorescent qui devient fluorescent lors de l'oxydation par les ROS. Embryons de poisson zèbre individuels sont déposés à la pipette dans les puits d'une microplaque et on les incube dans ce substrat fluorogène avec ou sans un inducteur chimique de la stimulation du métabolisme oxydatif. La fluorescence dans chaque puits est quantifiée à des points temporels souhaités en utilisant un lecteur de microplaque. Des lectures de fluorescence sont ajustés pour éliminer la fluorescence de fond et compared l'aide d'un test t non apparié. Cette méthode permet de comparer le potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre à différents stades de développement et en réponse à des manipulations expérimentales telles que la protéine effet de choc, la surexpression, ou un traitement avec des agents pharmacologiques. Ce procédé peut également être utilisé pour surveiller la réponse de la stimulation du métabolisme oxydatif dans les reins disséqué entières ou des préparations de cellules de reins de poisson zèbre adulte et une autre espèce de poisson. Nous croyons que la relative simplicité et l'adaptabilité de ce protocole complètent les protocoles existants et seront d'intérêt pour les chercheurs qui cherchent à mieux comprendre la réponse immunitaire innée.

Introduction

Le système immunitaire comprend deux branches: l'immunité innée et adaptative. L'immunité innée est évolutif plus ancienne que l'immunité adaptative. Invertébrés sont actuellement pensé pour avoir seulement l'immunité innée, alors que les vertébrés possèdent deux branches innées et adaptatives. Alors que l'immunité adaptative confère une immunité spécifique et de longue durée à certains agents pathogènes, l'immunité innée est une réponse immédiate aux bactéries envahissantes, les virus et les champignons. Un aspect crucial de la réponse immunitaire innée implique la libération de cytokines et de chimiokines, ce qui entraîne l'inflammation ....

Protocole

Une. Soins poisson zèbre et d'entretien

1. Élevage: poisson zèbre adulte d'apparition de masse comme décrit précédemment ^13. Recueillir des embryons engendrés comme décrit précédemment ^14.
2. La micro-injection (si désiré): micro-injection 1-4 poisson zèbre embryons au stade de cellules avec des oligonucléotides morpholino à knockdown produits géniques ou ARNm pour surexprimer produits géniques comme décrit précédemment ^15.
   1. Maintenir un bassin suffisant de la maquette contrôles injectés (au moins 48 Résidant, maquette injecté poissons témoins et 48 vivant, poissons expérimentalement manipulé sont nécess....

Résultats

Ici, nous fournissons des données comparant la réponse à l'éclatement respiratoire dans embryons de poissons zèbres (de type sauvage, AB fond) à 48 et 72 heures après la fécondation (HPF). Les 48 embryons de HPF agi comme notre groupe de contrôle et les 72 HPF embryons que notre groupe expérimental. La taille de l'échantillon utilisé était de 24 embryons induite Nations unies et les 24 embryons PMA-induites par stade de développement. Lectures de fluorescence brutes (en unités relatives de fluorescence (RFU)) on.......

Discussion

La fonction principale des phagocytes est de détecter, engloutir, et détruire les agents pathogènes. La capacité des phagocytes pour produire une explosion respiratoire adéquate est essentielle pour cette fonction. Ainsi, la quantification de la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif est une méthode pour permettre la comparaison de la santé générale immunitaire innée et la fonction entre des groupes d'individus et / ou en réponse à des manipulations expérimentales. Ici, nous décrivons un protocole pour indui.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sel de mer Instant Ocean	Instant	Ocean SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grammes
DMEM/F-12, sans phénol Red	Life Technologies	11039-021
Boîtes de Pétri profondes	VWR	89107-632
Pipettes de transfert en plastique	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Microscopie électronique Sciences	72700-D
1,7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Tubes Coniques à Centrifuger	VWR	21008-918
Pipettes sérologiques de 5 ml	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Lecteur de microplaques multimode	BioTek	Contact BioTek
Black Microplaque 96 puits	VWR	82050-728
Réservoirs stériles de 25 ml	VistaLab	3054-2003
P200 Pipette	Gilson	F123601
Pipette	multicanauxVWR	89079-948
Pointes de pipette	VWR	89079-478