Derribo Gene a gran escala en C. elegans Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

Resumen

Mientras dsRNA alimentación en C. elegans es una poderosa herramienta para evaluar la función de los genes, los protocolos actuales para pantallas de alimentación a gran escala resultan en eficiencias desmontables variables. Se describe un protocolo mejorado para realizar a gran escala pantallas de alimentación de RNAi que se traduce en caída altamente eficaz y reproducible de la expresión génica.

Resumen

ARN de interferencia alimentando gusanos bacterias que expresan dsRNAs ha sido una herramienta útil para evaluar la función de genes en C. elegans. Si bien esta estrategia funciona bien cuando un pequeño número de genes están dirigidos por caída, pantallas de alimentación a gran escala muestran eficiencias variables desmontables, lo que limita su utilidad. Hemos deconstruido protocolos desmontables de RNAi publicados previamente y se encontró que la fuente primaria de la caída reducida puede atribuirse a la pérdida de plásmidos que codifican dsRNA de las bacterias alimentados a los animales. Basándose en estas observaciones, hemos desarrollado un protocolo de alimentación de dsRNA que reduce en gran medida o elimina la pérdida de plásmido para lograr eficiente, de alto rendimiento de la precipitación. Se demuestra que este protocolo producirá robusto, reproducible golpe abajo de C. elegans genes en múltiples tipos de tejidos, incluyendo las neuronas, y permitirán caída eficiente en pantallas de gran escala. Este protocolo utiliza una alimentación de dsRNA disponible comercialmentebiblioteca y describe todos los pasos necesarios para duplicar la biblioteca y realizar pantallas de ARN de doble cadena. El protocolo no requiere el uso de cualquier equipo sofisticado, y por lo tanto puede ser realizada por cualquier C. elegans laboratorio.

Introducción

Históricamente, las pantallas de genética en C. elegans se han realizado mediante el tratamiento de los animales con un mutágeno químico tal como metanosulfonato de etilo para crear mutaciones aleatorias dentro del DNA. Progenie o grandprogeny de animales mutados son entonces aislados que presentan un fenotipo anormal deseado. La mutación responsable de causar el fenotipo se identifica a continuación a través de un procedimiento de asignación de mano de obra intensiva o mediante la secuenciación de todo el genoma del gusano mutante. Hay muchas ventajas a la realización de este tipo de pantallas de mutagénesis química, ya que crean lesiones permanentes en el genoma del gusano que pueden resultar en ambos fenotipos con ganancia de función y la pérdida de la función, pero el procedimiento de asignación es lento y costoso.

La interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) proporciona un medio alternativo para identificar genes implicados en procesos biológicos importantes. En este método, dsRNA a juego la secuencia de codificación de un gen endógeno se introduce en el gusano.El dsRNA se procesa en vivo para generar pequeños RNAs (21-22 nucleótidos) que sirven como guías para encontrar y se unen los ARNm endógenos a juego, la orientación para su destrucción ^1. Este procedimiento es relativamente rápido, sino porque dsRNA mRNA objetivos en lugar de ADN, sólo los fenotipos de reducción de la función, cuando se utilice este enfoque.

Introducción de ARNbc en un animal se puede lograr mediante la inyección directa de dsRNA ^2, empapando animales en dsRNA ^3, o por la alimentación de animales bacterias que expresan dsRNA ^4. Cada uno de estos métodos de entrega causan efectos sistémicos desmontables como la mayoría de las células del animal expresan SID-1, un canal transmembrana capaz de importar dsRNA ^5. Originalmente utilizado como un enfoque de genética inversa para derribar la expresión de genes individuales uno a la vez, el desarrollo de dos bibliotecas de alimentación permite ahora pantallas genéticos a gran escala. Las bibliotecas de dsRNA comercialmente disponibles contienen baclones cterial que representan ya sea el 55% o el 87% de toda la C. elegans genes ^{6, 7.}

Por desgracia, las pantallas de alimentación dsRNAi gran escala a menudo resultan en eficiencias desmontables variables ^8-10. Mientras que el nivel absoluto de la caída de RNAi no se mide fácilmente, la eficiencia reducida caída observada en pantallas de gran escala debe ser causado por residuales ARNm de genes específicos que escapan a la degradación por RNAi. Esto, a su vez, podría ser un resultado directo de dsRNA pérdida de plásmido a partir de bacterias alimentados a los animales en estas pantallas. Apoyando esta idea, los animales alimentados con mezclas de bacterias, en el que sólo el 50% de las bacterias expresan dsRNA contra un gen diana, muestran reducido dramáticamente (en su caso) efectos desmontables en comparación con los animales de control alimentados con ^11. La extensión de la caída de genes se convierte en una preocupación fundamental al realizar pantallas dsRNAi como la mayoría de los genes en C. elegans son haplosufficient y por lo tanto la expresión de genes que deben reducirse en al menos un 50% to causar la pérdida de la función de los fenotipos ^12.

Hemos utilizado los protocolos de alimentación previamente publicados para realizar pantallas de gran escala y ha encontrado los mismos efectos derribo variables reportadas por otros ^8-10. En la búsqueda de las posibles causas, se encontró que casi el 60% de las bacterias alimentadas a animales en la pantalla había perdido el plásmido dsRNA. Hemos desarrollado un protocolo de la duplicación y el cribado de la biblioteca que reduce drásticamente o elimina la pérdida de plásmido y mejora en gran medida la eficiencia desmontables. Este protocolo es adecuado para la realización de pantallas de gran escala en C. elegans y se puede utilizar para detectar ya sea una de las bibliotecas de dsRNA disponibles comercialmente. Usando este protocolo, nos encontramos con que esencialmente el 100% de las bacterias a los animales alimentados durante la pantalla de retener el plásmido dsRNA-codificación y causa la pérdida robusto y altamente penetrante de fenotipos de función en todos los tejidos examinados.

Protocolo

Nota: Este protocolo se puede utilizar para identificar los genes requeridos para una variedad de procesos biológicos en una variedad de tipos de tejidos. Como un control de calidad necesario durante la pantalla, los animales son alimentados tanto positivos como negativos bacterias que expresan dsRNA de control para demostrar los efectos de RNAi en el tejido diana.

Otros protocolos de alimentación publicados crecen bacterias dsRNA-expresan en presencia de ya sea 50 mg / ml de ampicilina o 25 mg / ml de carbenicilina ^8-10. Hemos encontrado que las bacterias cultivadas bajo cualquiera de estas condiciones pierden el plásmido de dsRNA a alta frecuencia. De hecho, hemos encontrado que incluso cuando las bacterias se cultivaron durante la noche en concentraciones muy altas (hasta 2 mg / ml) de ampicilina más de 50% de las bacterias ya no contienen plásmido. Si bien el crecimiento en carbenicilina generalmente dio como resultado una mayor retención de plásmido, 25 g / ml no fue suficiente para evitar la pérdida de plásmido. En lugar de ello, se encontró que la concentración carbenicilinaSe requieren ciones de 500 g / ml para bloquear la pérdida de plásmido durante el crecimiento en cultivos líquidos y 2 mg / ml de carbenicilina se requiere para bloquear la pérdida de plásmido cuando las bacterias se hicieron crecer en sustratos de agar sólido.

Debido a la retención de plásmido es crítica para el éxito de caída, sólo carbenicilina se utiliza cuando las bacterias de dsRNA se cultivan en este protocolo. Hemos optimizado cuidadosamente la concentración de carbenicilina utilizado en los cultivos de crecimiento bacterianos descritos en este protocolo para asegurar que las bacterias que no contienen plásmido no crecen en estos cultivos. Sin embargo, como medida de control de calidad, pérdida de plásmido se determina en varias etapas del protocolo. Para garantizar la caída eficiente, más de 80% de las bacterias en cada uno de estos pasos debe contener plásmido dsRNA. Si más del 20% de las bacterias en cualquier paso del protocolo han perdido el plásmido dsRNA, comprobar la calidad de la carbenicilina utilizado. Carbenicilina debe ser preparado fresco el día en que se utiliza. Preparar carbenicilina fresco y repetir la cultura.

1. Cómo determinar la pérdida de plásmido

1. Retirar una pequeña muestra de las bacterias (como se describe en cada paso relevante) y agregarlo a 450 l de agua estéril.
2. Utilice 100 l de esta muestra diluida para crear más 1:10, 1:100 y 1:1.000 diluciones seriadas usando agua estéril, mezclar las soluciones a fondo entre la dilución.
3. Corre 100 l de cada dilución en placas LB y LB AMP e incubar estas placas durante la noche a 37 ° C.
4. El día siguiente, identificar la placa de LB que contiene entre 100 y 500 colonias bacterianas. Contar el número de colonias en esta placa y en la placa de LB AMP correspondiente (que contiene la misma dilución de bacterias).
5. Determinar la pérdida de plásmido a partir de estos recuentos de colonias. El por ciento de bacterias que no contienen el plásmido se calcula utilizando la Ecuación 1, y deben ser inferior a 15% para la efectiva dsRNA derribar.

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2. Fabricación de las placas duplicadas Biblioteca

Resumen: La biblioteca dsRNA llegará del fabricante (OpenBiosystems) como 10.566 clones bacterianos en placas de 96 pocillos. Almacenar las placas inmediatamente en -80 ° C congelador. Las placas de biblioteca original se duplicarán y todas las pantallas de alimentación utilizarán las placas de la biblioteca duplicados como la fuente de bacterias. Es recomendable guardar el original y duplicar las placas de la biblioteca en los congeladores separados. Para recomienda facilidad de manejo, la duplicación de sólo 10 placas de la biblioteca por día.

1. Retire la placa de la biblioteca (s) de -80 ° C congelador y quitar el sello de aluminio, mientras que las culturas siguen congeladas. Vuelva a colocar la cubierta de plástico de la placa de la biblioteca y fijar la placa en una superficie plana que se descongele a temperatura ambiente (no superior a 30 minutos).

Nota: Hemos tomado nota de que una p significativaorcentaje de bacterias que se encuentran en cada pocillo de las placas de la biblioteca originales no contienen plásmido. Sin embargo, debido a que las bacterias de la biblioteca son un recurso muy valioso que no se recomienda para la prueba de pérdida de plásmido en las culturas originales de la biblioteca.

2. Usando una pipeta multicanal, añadir 150 l de los medios de comunicación duplicación biblioteca a cada pocillo de una placa de duplicado vacío 96 pocillos de fondo plano.
3. Mezclar los cultivos bacterianos biblioteca descongelados pipeteando arriba y abajo cuatro o cinco veces con una pipeta multicanal ajustado a 100 l. A continuación, retire 10 l de cada cultivo mixto y la transferencia a los correspondientes pocillos de la placa por duplicado. Continuar para transferir las culturas de la placa de la biblioteca para duplicar placa asegurándose de cambiar las puntas de pipeta para cada transferencia.
4. Después de todas las culturas de una placa de la biblioteca han sido transferidos, cubra los pocillos de la placa de la biblioteca original con un nuevo folio adhesivo con un rodillo rodillo para asegurar un sellado completo. Vuelva a colocar la tapa de plástico en la placa ycolocar en posición vertical en un congelador de -80 ° C hasta que los cultivos han vuelto a congelar (al menos 30 min). A continuación, mueva las placas originales de la biblioteca de nuevo en una caja de almacenamiento de la biblioteca.
5. Agitar cultivos en placa biblioteca duplicados planas para 8-10 horas a 37 ° C (450 rpm en un microagitador, la órbita de 3 mm).
6. Determine la pérdida de plásmido en cada placa biblioteca duplicado. Hemos encontrado que una alta proporción de las bacterias en cada pocillo de la placa de biblioteca original no contenía plásmido dsRNA. Es importante que estas bacterias no contribuyen al crecimiento en la biblioteca duplicado. Para evitar su crecimiento, una alta concentración de carbenicilina se utiliza en los medios de biblioteca de duplicación (3 mg / ml). Después del cultivo de la placa de la duplicación utilizando estas condiciones, se encontró que más del 90% de las bacterias contienen plásmido dsRNA. Retire 10 l de muestra de un pozo cultura representativa de cada placa por duplicado y agregarlo a 450 l de agua estéril. El uso de estas muestras diluidas, determinar la pérdida de plásmido en cada biblioteca duplicadoplaca de acuerdo a los pasos 1.1 a 1.4. Si se observa la pérdida de plásmido significativa (> 20% de las bacterias en la biblioteca duplicado no contienen plásmido), rehacer los medios de cultivo usando carbenicilina fresco y repetir el protocolo de la etapa 2.1.
7. Después de la incubación, colocar una nueva hoja de papel de aluminio adhesivo directamente sobre los pocillos de la placa por duplicado, y colocar las tapas de la placa sobre esta lámina. Coloque las placas de la biblioteca duplicados en posición vertical en un -80 ° C congelador (al menos 30 min) hasta que se congele. Una vez congelado, mover las placas a la caja de almacenamiento de la biblioteca duplicado para el almacenamiento a largo plazo.

3. Realización de copias temporales de la Biblioteca en Omniplates

Resumen: Para comenzar a preparar la comida para una pantalla de dsRNA, las bacterias de las placas de la biblioteca duplicados se transfieren a omniplates agar sólido y crecer durante la noche. Para evitar la pérdida de plásmido en medios sólidos, omniplates contiene carbenicilina a 2 mg / ml. Las bacterias en estas placas se pueden utilizar para un períodode una semana, y no muestran pérdida de plásmido. No hemos probado para la pérdida del plásmido en bacterias cultivadas en omniplates más de una semana.

1. Retire la placa de la biblioteca duplicado (s) de -80 ° C congelador y quitar el sello de aluminio, mientras que las culturas siguen congeladas. Después de quitar el papel de aluminio, coloque la cubierta de plástico de la placa y fijar la placa de la biblioteca dos ejemplares en una superficie plana que se descongele a temperatura ambiente (no superior a 30 minutos).
2. Esterilizar el pin replicador Boekel 96. Los pines de un replicador limpia deben ser enjuagados con agua destilada y luego se esterilizan antes de cada uso. Para esterilizar el replicador, colóquelo en un baño de etanol (3/4 en el fondo de un plato de Pyrex) y luego quemar el etanol recubriendo los pins de usar un mechero Bunsen. Permita que la llama se extingue y luego repetir.
3. Coloque el replicador esterilizada en los pocillos de la placa duplicada descongelado y lo utilizan para remover suavemente las culturas. Pequeños volúmenes de la cultura se adherirán a las estacas del replicador.
4. Retire con cuidado el replicador de los pocillos de la placa duplicada y colocarlo (pines hacia abajo) suavemente sobre la superficie de la omniplate, teniendo cuidado de no perforar la superficie del agar. Deje el replicador en la superficie de la omniplate durante 3-4 seg para que las bacterias de los pasadores de la replicador se transfieren sobre la superficie del agar.
5. Retire el replicador y deje que el pequeño volumen (2-3 l) de cultivo bacteriano se absorba en el agar. Incubar las omniplates invertidas para 15-18 horas a 37 ° C. Estos omniplates se pueden utilizar a la mañana siguiente para inocular 96 culturas bien líquidos. Alternativamente, omniplates contienen colonias de bacterias durante la noche se pueden almacenar hasta siete días a 4 ° C.
6. Para la réplica de transferencia de placas duplicadas adicionales, enjuague la punta del replicador con agua estéril y repetir el proceso de esterilización mediante la colocación del replicador en etanol y en llamas dos veces, como antes. Una vez esterilizado, el replicador se puede utilizar en la siguiente placa duplicado.

4. Preparación de las bacterias para Feeding Worms

OANORAMA: Las bacterias se alimentan de gusanos se preparan como 1 ml de cultivos líquidos (en un formato de 96 pocillos) utilizando bacterias de los omniplates. Estos cultivos líquidos se cultivaron durante la noche para generar cultivos bacterianos nonlogarithmic saturados. Noche de crecimiento, se asegura de que todas las culturas contendrán concentraciones similares de bacterias y por lo tanto todos los gusanos serán alimentados con la misma cantidad de alimento. No debe observarse pérdida de plásmido durante este crecimiento.

1. Dispensar 1 ml de medio de crecimiento bacteriano en cada pocillo de 2 ml de pozo profundo de la placa de 96 pocillos usando una pipeta de repetición y 50 ml de Combitip.
2. Coloque replicador estéril sobre la superficie de omniplates que contienen colonias bacterianas obtenidos en los pasos 3.1 a 3.6 asegurándose de que los pins están en contacto con cada una de las 96 colonias bacterianas.
3. Mover con cuidado el replicador de la superficie de la omniplate en la placa de pozo profundo asegurándose de que los pasadores no se eliminan los lados de los pozos profundos hasta inmerso en medio de crecimiento. Mueva elreplicador lentamente en un movimiento cuadrado siguiendo la pared interior de la placa de pozo profundo para desalojar las bacterias en el medio de crecimiento. Tenga cuidado de no salpicar y cruz contaminan pozos.
4. Los pocillos de control: Para cada placa de cultivo de 96 pocillos pozo profundo añadir una bacteria de dsRNA que expresan a un pocillo que actuará como un control positivo para la desmontables fenotipo esperado y añadir las bacterias que contienen el vector vacío de dsRNA (pL4440) como control negativo a otro así . Nos re-racha de control de dsRNA-expresando bacterias una vez por semana en placas de LB que contenían tetraciclina (15 mg / ml) y carbenicilina (2 mg / ml) de modo que las bacterias permanecen frescas y retienen plásmido.
5. El uso de un asa de inoculación estéril eliminar un solo pozo aislado de colonias de la placa de control (aproximadamente la misma cantidad de bacterias transferidas por el replicador) e inocular un pozo vacío en la placa de cultivo de pozo profundo. Registrar la posición del pozo que ha sido inoculado. Alternativamente, el lazo con bacterias cun ser movido a un tubo Eppendorf que contiene 250 l medio de cultivo, vórtex y luego para inocular varios pozos.
6. Agitar las placas de pozos profundos en una posición plana a 650 rpm en microagitador (órbita: 3 mm) a 37 ° C durante la noche. Los cultivos estarán saturados por la mañana siguiente. Independientemente, la concentración de carbenicilina utilizado en estos cultivos debería evitar la pérdida de plásmido.
7. Determine la pérdida de plásmido en los cultivos de 1 ml durante la noche. Los cultivos se pueden usar directamente para alimentar a los gusanos de la pantalla. Es importante que más de 80% de las bacterias en cada cultivo contiene plásmido dsRNA. Determine la pérdida de plásmido de dos culturas representativas de acuerdo a los pasos 1.1 hasta 1.4. Expectativa: Más del 90% de las bacterias en cada cultura contendrá plásmido dsRNA. Nunca hemos observado una pérdida significativa plásmido en estos cultivos durante la noche, incluso cuando crece hasta la saturación. Sin embargo, si se observa la pérdida de plásmido significativa (> 20%), rehacer los medios de crecimiento usando carbenicilina fresco y representantecomer protocolo desde el paso 4.1. Las culturas pueden ser renovadas a partir de los omniplates originales, siempre y cuando los omniplates están a menos de 1-2 semanas de edad.
8. Una vez utilizado para iniciar 1 ml de cultivos, los omniplates se almacenan a 4 ° C hasta que se completó la pantalla y se puede utilizar como una fuente de comida para empezar cualquier culturas retest.
9. Después de la incubación durante la noche de las culturas, utilizar una pipeta multicanal de 12 canales para eliminar 150 l de cultivo bacteriano de la placa de pozo profundo y expulsar sobre la superficie de la placa de alimentación. Es importante no perforar la superficie del agar durante la transferencia como gusanos madriguera y no se alimentan de las bacterias que expresan dsRNA. Transferencia se puede hacer cuatro pozos en un momento (Figura 1). Para ello, coloque las puntas de pipeta en cada tercer canal de la pipeta multicanal (ya que hay sólo 4 pocillos por cada fila de la placa de alimentación). Después se transfiere cada conjunto de 4 pozos, cambiar a nuevas puntas de pipeta estériles. Cada placa de 96 pozos profundos cultura requerirá 96 puntaspara la transferencia a ocho placas de alimentación de 12 pocillos.
10. Tienda placas sembradas en posición vertical en la oscuridad durante la noche para que las bacterias se pueden absorber en el agar.

5. Generando L1 Arrestado C. elegans larvas

Resumen: larvas arrestadas-L1 se utiliza para iniciar cultivos de gusanos sincronizadas en las placas de alimentación de dsRNA. Estas larvas son generados por el blanqueo poblaciones de adultos grávidas para aislar los huevos sanos y luego permitiendo que los huevos eclosionan en los medios de comunicación S-completa sin comida. En la ausencia de alimento de las larvas eclosionadas L1 se detener el desarrollo, la generación de una población sincronizada de larvas L1. Durante la pantalla, preparar larvas L1-arrestado fresco cada semana ya que estos animales muertos de hambre se enferman con el tiempo y deben desecharse. La elección de la base genética de los animales utilizados en una cepa de alimentación dsRNA puede variar dependiendo de la aplicación, para pantallas neuronales eri-1; se recomiendan mutantes lin-15B.

1. Elige 10-20 L4 laRVAE seis NGM placas separadas que contienen un césped de bacterias OP50 y esperar 6-7 días hasta que las placas contiene muchos huevos recién puestos-y adultos grávidas.
2. Eliminar los animales y los huevos de las placas mediante la adición de 3 ml de agua a la superficie de cada placa y utilizar un dedo enguantado para desalojar los huevos, bacterias, y los animales de la superficie de cada placa en el agua. Asegúrese de cubrir todas las áreas de la placa, con especial atención al césped bacteriano. Retire el agua, las bacterias, los gusanos y los huevos de cada placa con una pipeta de vidrio y transferir a un tubo cónico de 50 ml estéril.
3. Añadir otros 3 ml de agua a la superficie de cada placa, pipeteando arriba y abajo a través de la superficie para eliminar todos los restantes bacterias, gusanos y huevos. Añadir este volumen al tubo cónico de 50 ml.
4. Haga girar el tubo cónico a 1.500 rpm durante 1 min en una centrífuga de mesa. Los gusanos y los huevos deben sedimentar en el fondo del tubo y las bacterias deben permanecer suspendidos. Aspirar cuidadosamente todos menos 4 mldel líquido desde el tubo asegurándose de evitar que los gusanos y los huevos sedimentadas.
5. Resuspender el precipitado gusano en el agua residual y transferir a un tubo cónico de 15 ml estéril usando una pipeta de vidrio. Llevar el volumen a 10 ml con agua estéril.
6. Giran a 1500 rpm durante 1 min como antes. Aspirar el sobrenadante dejando 200 l de agua a fin de no perturbar el sedimento gusano / huevo.
7. Añadir 10 ml de agua a la cónica para lavar los gusanos y los huevos y girar como antes para eliminar las bacterias adicionales.

Atención: En los pasos 5.8-5.11 los gusanos y los huevos están expuestos a un solución de cloro. Bleach destruirá gusanos y dejar los huevos relativamente ilesos. Sin embargo, si los huevos se dejan en una solución de lejía demasiado tiempo, también serán destruidos. Establecer un temporizador cuando se agrega la lejía en el paso 5.8 para tener la certeza de que los huevos no permanecen expuestos a lejía durante más de 10 min.

8. Retire todos menos 200 l del sobrenadante, evitando de nuevo el sedimento, a continuación, añadir 10ml de solución de lejía y comenzar un temporizador.
9. Incubar los gusanos y los huevos en una solución de lejía durante 3-4 minutos, mezclando de vez en cuando por inversión. Luego girar a 1500 rpm durante 45 segundos en una centrífuga de mesa. Busque un sedimento en el fondo del tubo, debe ser más pequeño y más compacto que el sedimento original y podría tomar una apariencia de color amarillo.
10. Aspirar la solución de cloro dejando 200 l detrás a fin de no perturbar el sedimento.
11. Añadir otra solución 10 ml de lejía fresca e invertir como antes. Cuando el tiempo se muestre 10 min, girar de nuevo y aspirar la solución de cloro, dejando a 200 l detrás y rápidamente agregar 10 ml de agua estéril. Examine la solución bajo un microscopio de disección. Las larvas y muchos de los adultos deberían haber disuelto en la solución de cloro, dejando a la mayoría de huevos atrás.
12. Girar como antes durante 45 segundos, y de nuevo aspirar el sobrenadante con el fin de no perturbar el sedimento. Este pellet debe contener principalmente huevos y será muy flojo.
13. Añadir anotsu agua de 10 ml, invierta para mezclar, efectos y aspirado dejando un poco de agua detrás. Es importante eliminar la mayor cantidad posible solución de cloro.
14. Añadir 4 ml de medio S-completos para el tubo cónico, volver a suspender los huevos y transferir a un matraz Erlenmeyer estéril 100. Colocar el matraz en un incubador de 20 º C en un conjunto agitador en movimiento lo suficientemente rápido como para hacer que el contenido del matraz a remolino. Esto proporcionará una aireación suficiente para apoyar las larvas L1 cuando salen del cascarón. Dentro de 15 horas todos los huevos deberían haber eclosionado producir una población sincrónica de larvas L1 arrestado.

Larvas L1 Arrestado debe hacerse fresca cada semana durante una pantalla. Una vez que el primer lote se ha hecho, los lotes subsiguientes pueden iniciarse mediante la adición de 500 larvas L1 arrestado (a partir de lotes de la semana anterior) a cada uno de los cuatro cabezas de serie placas estándar, 6 cm (que contiene 100 l cultivo de una noche de OP50), y se incubaron a 20 ° C durante 4 días. En el cuarto día las placas deben contenermuchos huevos y adultos grávidas y pueden blanquearse para preparar huevos frescos para las larvas L1 más sincronizado.

6. Transferencia Arrestado L1 larvas en placas de alimentación

Resumen: Para realizar una pantalla de dsRNA, 20-30 larvas L1 detenidos son transferidos a placas de alimentación de dsRNA. Se observaron efectos Early desmontables tales como arresto o larvas de letalidad después los animales se han alimentado de las bacterias que expresan dsRNA durante 2-3 días. Dependiendo de la pantalla realizada, fenotipos deseados se pueden observar tanto en los animales originales colocados en la placa de alimentación (animales P0) o en su progenie (animales F1). La presentación de fenotipo dependerá de un número de variables incluyendo la perduración de la proteína codificada por el gen cuya expresión es derribado y el tiempo durante el desarrollo en el que se requiere el gen de interés. A partir de cultivos de alimentación de dsRNA con sólo 20-30 animales debe permitir la observación de ambos P0 y F1 fenotipos antes de unimals agota la fuente de alimento.

Para transferir fácilmente 20-30 animales a las placas de alimentación, en primer lugar determinar la concentración de L1 detenido animales en la cultura L1 detenido.

1. Mezclar el erlenmeyer que contiene las larvas L1 arrestado para distribuir a los animales.
2. Retirar una alícuota de 10 l y lugar gota a gota sobre una placa de NGM 6 cm no cabeza de serie en 4-5 gotas en el centro de la placa de asegurarse de que todos los medios de comunicación es expulsado de la pipeta.
3. Usando el extremo de la punta de pipeta extendió los puntos de suspensión gusano para formar una sola línea continua de líquido que se extiende por el diámetro de la placa.
4. Usando un microscopio de disección, contar todos los animales a partir de un extremo de la línea de líquido y continuando hasta el otro extremo antes de que el líquido se ha absorbido en la placa y los animales dispersar. Esto puede requerir la reorientación constante del microscopio de disección para tener la certeza de que los animales no se pierden.
5. Repita esto para tres 10 l separadasalícuotas y promedian los tres números para determinar el número promedio de gusanos por l de suspensión de gusano y registrar este número directamente en el matraz Erlenmeyer.

7. Comience la pantalla Alimentación

Resumen: Para empezar la pantalla dsRNA, se añaden 20-30 larvas L1 arrestado a cada pocillo de placas de alimentación de 12 pocillos que contienen un césped fino de bacterias que expresan dsRNA. Placas de alimentación contienen medio de crecimiento de nematodos estándar (NGM) y se complementan con 500 mg / ml de carbenicilina (para evitar la pérdida de plásmido) y 1 mM de IPTG (para inducir la expresión de dsRNA). Animales se les permite alimentar y desarrollar durante varios días a 20 ° C. Dos regímenes de alimentación típicos para los animales son de 3 días en la realización de una pantalla de P0 y 6-7 días en que la realización de una pantalla de F1. La duración de la alimentación, sin embargo, se puede variar dependiendo de los fenotipos específicos buscados en la pantalla.

1. Utilice la suspensión de larvas L1 arrestado y agua estéril para preparar un modolución que contiene 2.000 gusanos / ml. Cada placa de alimentación de 12 pocillos requerirá 120 l de esta suspensión gusano. Mezclar a fondo para asegurar una distribución uniforme de los animales y transferir los animales a un depósito estéril para el pipeteado.
2. Usando la pipeta multicanal configurar con puntas en cada tercera posición (véase la Figura 1) de transferencia de 10 l de la solución de gusano directamente sobre el césped bacteriano de las placas de alimentación. Tenga cuidado de no perforar la superficie del agar, como gusanos madriguera en el agar y se alimenta de las bacterias que expresan dsRNA.
3. Remezcla la solución gusano en el depósito (por chapoteando suavemente sobre él) después de cada dos filas de placas de alimentación, como gusanos instalan rápidamente. Continuar la dispensación de la suspensión hasta que todas las placas de tornillo sin fin de alimentación tienen gusanos. Examine algunos pozos desde el principio bajo el microscopio de disección para asegurar que cada pozo es cada 20-30 gusanos.
4. Placas guárdelo en posición vertical en una caja humidificado en una incubadora de 20 ° C. Al día siguiente, después de que el wosuspensión RM ha absorbido en la placa, invertir las placas y volver a la humidificador a 20 ° C. Animales en estas placas pueden ser observados después de 3 días (para fenotipos P0) y de nuevo después de 6 días (para los fenotipos F1).

Nota: Las bacterias que permanecen en la placa de alimentación después de 7 días de crecimiento sin fin se han probado para la pérdida del plásmido y casi el 100% que se mantiene el plásmido dsRNA.

Resultados

Fenotipos desmontables P0 comenzarán a aparecer después de 2-3 días de alimentación de los animales dsRNA expresando bacterias. Algunos fenotipos tempranos incluyen la detención y la letalidad de las larvas y se deben observar en el 2-3% de todos los pozos que alimentan. Estos mismos fenotipos también se observaron en los animales de la generación F1. La presencia de huevos de F1 que no logran salir del cascarón es otro fenotipo F1 común, y juntos, se observará estos tres fenotipos en casi el 10% de todos los pozos en l...

Discusión

Hemos descrito un protocolo que utiliza una biblioteca de alimentación dsRNA disponible en el mercado para realizar pantallas de gran escala en C. elegans. Proporcionamos todas las instrucciones para duplicar la biblioteca y para utilizar de manera eficaz. Se demuestra que este enfoque es capaz de identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos en diferentes tejidos del animal. Mientras que los fenotipos que describimos aquí son fácilmente observables (UNC, Egl, y Dpy), este protocolo se puede ad...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
96 pocillos Placa de fondo plano Falcon	Fisher Scientific	353072
lámina adhesiva	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml de profundidad Polipropileno de 96 pocillos Masterblock	USA Scientific	5678-0285	Tapas esterilizables en autoclave
para placas de pocillos profundos	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	envueltos individualmente
Depósito	USA Scientific	2977-8500	autoclavable
placas de 12 pocillos	USA Scientific	CC7682-7512	envueltos individualmente
biblioteca de alimentación de dsRNA	OpenBiosystems	RCE1181	tienda -80 ° C
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetraciclina	Fisher Scientific	BP912-100
Carbenicillina			Espere de 2 a 4 semanas para la entrega www.biochemicaldirect.com
Agar bacteriológico Ultrapuro grado A	Affymetrix	10906	para placas helicoidales
Equipment
Rodillo Brayer	USA Scientific	9127-2940
B– Replicador KEL de 96 pines	Fisher Scientific	05-450-9	microagitador esterilizable en autoclave
	Thomas Scientific	1231A93	3 mm orbit
12 canales pipeta multicanal (0.5-10 μ l)	Pipeta	7112-0510
(30-300 μ l)	Pipeta manual USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus USA	Scientific	4026-0201