Utviklingsprosesser som spredning, mønster, differensiering, og axon veiledning kan lett modellert i sebrafisk ryggmargen. I denne artikkelen beskriver vi en monteringsprosedyre for sebrafisk embryo, som optimaliserer visualisering av disse hendelsene.
Den sebrafisk ryggmargen er en effektiv unders modell for nervesystemet undersøkelser av flere grunner. For det første kan genetisk, transgene og genet knockdown tilnærminger benyttes for å undersøke de molekylære mekanismer som ligger til grunn nervesystemet utvikling. For det andre, store klørne til utviklingshemmede synkronisert embryoer gir store eksperimentelle utvalgsstørrelser. Tredje, den optiske klarhet i sebrafisk embryo tillater forskere å visualisere stamfar, glial, og nevronale populasjoner. Selv om sebrafisk embryo er gjennomsiktige, kan prøven tykkelse hindre effektiv mikroskopisk visualisering. En årsak til dette er den tandem utvikling av ryggmargen og liggende somitt vev. En annen grunn er den store eggeplomme ball, som fortsatt er til stede i perioder med tidlig neurogenesis. I denne artikkelen viser vi microdissection og fjerning av eggeplomme i faste embryoer, som tillater mikroskopisk visualisering samtidig bevare rundt somitt vev. Vi also demonstrere semipermanent montering av embryoer sebrafisk. Dette tillater observasjon av neurodevelopment i dorso-ventrale og anterior-posterior akser, som det bevarer tredimensjonalitet av vevet.
Visualisering av ryggmargen i sebrafisk hemmes av en rekke faktorer. På grunn av tykkelsen av de overliggende somites og den indre beliggenheten av ryggmargen, er en betraktelig lang arbeidsavstand som kreves for høy cellulær oppløsning. Plomme ball (som fortsatt er til stede under tidlige stadier av neurogenesis) ytterligere øker arbeidsavstanden som kreves, og blir lett skadet etter press fra et dekkglass. I tillegg, rusk fra skadede plomme forbyr klar visualisering av vev. Selv om tverrsnitt i dorso-ventral (DV) aksen er mulig, har de ikke lett tillate samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) aksen en.
For å overvinne disse hindringene, er embryoer dissekert og montert på lysbilder. Denne fremgangsmåten gir flere fordeler. Først, sebrafisk embryo lett ligge med den laterale siden vendt oppover, noe som letter AP aksen visualisering. For det andre, fjerning av plomme ball reduserer den nødvendige arbeidsavstand, og begrenser rusk. Tredje, gir dette monteringsprosedyre for både fluorescerende og lysfelt mikroskopi. Fjerde, montert embryoer er stabil i flere måneder ved 4 ° C, slik at langvarig prøven visualisering. Endelig forekommer progresjon av utviklingen ved at fremre segmenter er mer modne enn bakre segmenter. For å sikre at iscenesatt matchet spinal hemisegments sammenlignes mellom embryoer, er liggende somitt vev som brukes som en veiledning. For eksempel ligger over den tiende mest posterior somitt den tiende spinal hemisegment, som er utviklingsmessig tilsvarende i scene-matchet embryoer. Denne monteringsmåten av intakte fostre gir enkel identifisering av somites.
Vi bruker genetikk og gen knock-down teknologier for å studere mekanismene for axon veiledning i utviklingsryggmargen. Spesielt har vi fastslått at robo2, robo3 og DCC er nødvendig for commissural Primær ascending (COPA) axon pathfinding. Bruke påsettingsprosedyren beskrevet her, var vi i stand til å undersøke ventral vekst, midtlinjen krysset, commissure bredde, rygg-og anterior vekst 2,3. Denne monteringsmåten kan også anvendes på DV-eller AP mønster av ryggmargen. Vi har brukt denne fremgangsmåten for å finne ut ulike roller nedstrøms Wnt effektorer i DV fordelingen av ryggmargen. Ved hjelp av denne montering, var vi i stand til å oppnå en løsning på DV-markører på celle-nivå, og bestemme minutt mønster skift som følge av endrede Wnt signalmottak 4,5. Denne monteringsmåten gir også mulighet for mitotiske indeksen beregningen gjennom anti-phosphohistone tre eller BrdU merking (stamfar spredning) differensiering fem.
Lateral montering av faste sebrafisk embryo hjelpemidler visualisering av ryggmarg utvikling. Ved fjerning av plomme ball, er arbeidsavstanden som kreves for eksepsjonell mikroskopisk avbildning reduseres. Våre representative resultater ble begrenset til 24 HPF stadium, kan imidlertid denne teknikken benyttes så tidlig som 18 HPF, skjønt tidligere embryoer er vanskeligere å dissekere på grunn av størrelsen av embryoet og skjørheten av vevet. Denne teknikken er også aktuelt å fostre eldre enn 24 HPF. Med hjelp av den optiske klarhet i embryonale sebrafisk, evnen til å utføre termin genetiske skjermer, revers genetikk, og transgene nærmer seg, kan flere utviklingsprosesser bli undersøkt. Dette inkluderer mitotiske indekser av nevrale stamceller med markører som BrdU og anti-fosfor-histone 4 til 6 mars og mønster gjennom uttrykk for nevronale og gliaceller progenitor markører i pax, nkx, dbx, og olig Familiers 1,4-6. Reagenser som rapporterer glial og neuronal-bestemmelse (eksempel glial fibrillary syreprotein (GFAP) og HUC / D) 1,4,5,10 kan benyttes. Nevronale subtype differensiering kan analyseres gjennom uttrykk for holme, VSX, engrailed, og gata gener 1,4-6. Og til slutt, er analyse av axon veiledning mulig gjennom antistoffer som anti-acetylert tubulin, 3A10, og znp-en 2,11,12. Selv om andre vertebrate modellsystemer (mus og kylling) blir brukt til å studere ryggmarg utvikling, bare den sebrafisk tillater samtidig visning av alle utviklings akser i intakt embryo.
Den åpenbare begrensningen for denne tilnærmingen er at embryoene er løst, noe som utelukker direkte avbildning. Faktisk fjernet (eller skade) eggeplomme fører til hurtig død embryonale, og dermed er det ikke mulig å redusere arbeidsavstanden i levende embryoer ved hjelp av denne teknikk. Men høy forstørrelse spinal cord bildebehandling i levende embryoer er mulig. For å bevare plommen under live bildebehandling, kan embryo plasseres i depresjon lysbilder, som gir et større mellomrom mellom prøven og dekkglass. Alternativt kan flere 22 mm x 22 mm Dekk limes på enten lysbilde av et tre i x 1 i mikroskopisk lysbilde. Dekk tjene som en "bro" for den overliggende dekkglass. Hvis embryoer er eldre enn 18 HPF, er Tricaine brukt til å bedøve embryoer for å hindre bevegelse. Mens en arbeidsavstand på 0.288 mm er nødvendig for deyolked embryoer på 24 HPF, når du arbeider med levende embryoer innebygd i agarose, med intakte plommer, er nok et mikroskopisk linse med en arbeidsavstand på 3,3 mm. Alternativt kan eksplantering kulturer som stammer fra deyolked embryoer bli visualisert ved hjelp av en plasma blodpropp immobiliseringsteknikken 13. Forskjellige grupper av celler kan observeres ved bruk av genetisk kodede fluorescerende proteiner som GFP, mCherry eller Photoconkonvertible fargestoff Kaede (for å nevne noen). Videre kan fluorescensmerkede celler i løpet av kimære embryoer også sees med denne tilnærmingen 14.
En konsekvent monteringsteknikk som er stabil i flere måneder er et kritisk verktøy for utviklings-og cellebiologer. Denne enkle teknikken er reproduserbar, noe som gir enkel sammenligning mellom ulike eksperimentelle studier. Videre justering av embryoer i rader lett tillater identifisering av spesifikke embryoer for senere analyse.
The authors have nothing to disclose.
Skidmore Fakultet Development Grant finansiert utarbeidelse og publisering av dette manuskriptet.
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
|
Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |