Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.
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Methodenartikel
Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.
Einleitung
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der....
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Protokoll
Ethik-Erklärung
Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513).
1. Herstellung von Kollagen-Gels
Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze.
- Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließl....
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Ergebnisse
Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um die.......
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Diskussion
Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermöglicht die g.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM Pulver | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| Steriflip Vakuumfiltrationssystem in Biotechnologiequalität (0,22 Mikron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin-Lösung, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fötales Rinderserum | Wisent | 095-150 | Hochwertiges |
| Kollagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Verdünnt aus 10 N Stamm, dann sterilfiltriert |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-Well-Platte | BD Biowissenschaften | 353047 | |
| Präparierschere | Fisher Scientific | 089515 | |
| Petrischale aus Glas | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| Präpariermikroskop | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Pinzetten | Fine Science Werkzeuge | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | |
| Chirurgische Klinge | in | 21 | |
| Allzweck Instant Krazy Kleber Stift | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Mikrotom mit vibrierender Klinge | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Tabelle der spezifischen Reagenzien und Ausrüstung. |
Referenzen
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Oberma....
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Nachdrucke und Genehmigungen
