Menneske endogene retrovirus (Herv), som opptar 8% av det menneskelige genom, beholde knappe koding kapasiteter, men hundre tusen lange terminal gjentar (ltr). En tilpasset Affymetrix microarray er designet for å identifisere individuelle Herv locus uttrykk og ble brukt på prostata kreft vev som en proof of concept for fremtidige kliniske studier.
Prostata-spesifikt antigen (PSA) er den viktigste diagnostiske biomarkører for prostatakreft i klinisk bruk, men det mangler spesifisitet og sensitivitet, spesielt i lave doser verdier en. 'Slik bruk PSA' forblir et nummer, enten for diagnose som en grå sone som svarer til en konsentrasjon i serum fra 2,5-10 ng / ml som ikke tillater et klart skille gjøres mellom kreft og noncancer 2 eller for pasienten å følge -up som analyse av postoperativ PSA kinetiske parametere kan utgjøre betydelige utfordringer for deres praktiske anvendelse 3,4. Alternativt blir noncoding RNA (ncRNAs) fremstår som viktige molekyler i menneskelig kreft, med potensial til å tjene som nye markører for sykdom, f.eks PCA3 i prostatakreft 5,6 og for å avdekke uncharacterized aspekter av tumorbiologi. Videre data fra ENCODE prosjekt som ble publisert i 2012 viste at ulike RNA-typer dekker ca 62% av genome. Det fremgår også at mengden av transkripsjonelle regulatoriske sekvensene er minst 4,5 ganger høyere enn den som svarer til protein-kodende eksoner. Således lange terminale repetisjoner (ltr) av human endogenous retrovirus (HERVs) utgjør et bredt spekter av putative / kandidat transkripsjonsregulerende sekvenser, som det er deres primære funksjon i infeksiøse retrovirus. HERVs, som er spredt over hele det menneskelige genom, stammer fra forfedrenes og selvstendige infeksjoner innenfor kjønnsceller, etterfulgt av copy-paste forplantning prosesser og fører til Multicopy familier opptar 8% av det menneskelige genom (merk at eksoner span 2% av genomet vårt ). Noen Herv loci fortsatt uttrykke proteiner som har vært forbundet med flere sykdommer, inkludert kreft 7-10. Vi har utviklet en high-density microarray, i Affymetrix format, med formål å optimalt karakterisere individuelle Herv loci uttrykk, for å bedre forstå om de kan være aktive, hvis de kjører ncRNA transkripsjon eller modulate koding genuttrykk. Dette verktøy har vært anvendt i prostata cancer felt (figur 1).
Menneske endogene retrovirus (også kalt HERVs) er spredt over hele genomet vårt. De stammer fra forfedrenes og selvstendige infeksjoner innenfor kjønnsceller, etterfulgt av copy-paste forplantning prosesser og fører til multikopiplasmider familier. I dag er de ikke mer smittsomme men de opptar 8% av det humane genom, som et punkt i sammenligning eksoner span 2% av det humane genom. Data fra ENCODE prosjekt som ble publisert i 2012 viste at ulike RNA-typer dekker ca 62% av genomet, inkludert en tredjedel i intergenic regioner. Dessuten viser det seg at mengden av transkripsjonsregulerende motivene er minst 4,5 ganger høyere enn den som svarer til protein-kodende eksoner. HERVs lang terminal repetisjoner (Ltr) representerer et bredt spekter av potensielle transkripsjonsregulerende elementer, som det er deres vanlige funksjon i infeksjonsretrovirus. Historisk sett, bortsett fra noen få loci uttrykt i morkaken eller testikkel, det var vanlig å tro at Herv er tause på grunn av epigenetic regulering. Derfor har vi utviklet en high-density microarray, i Affymetrix format, med formål å optimalt karakterisere individuelle Herv loci uttrykk, for å bedre forstå om de er aktive, hvis de kjører lncRNA transkripsjon eller modulere koding genuttrykk. Dette verktøyet kalt Herv-V2 Genechip integrerer 23583 Herv probesets og kan diskriminere 5573 distinkte Herv elementer sammensatt av solo Ltrs samt komplette og partielle provirus (figur 2).
Diagnose, Assessment, og Plan:
Diagnostisering av prostatakreft er basert på dosering av prostata spesifikt antigen (PSA) biomarkør i klinisk laboratorium, en digital rektal undersøkelse for å evaluere morfologisk endring av prostata og til slutt prostatabiopsier observert av patologen. Mangelen på tilstrekkelig spesifisitet og sensitivitet hos konvensjonelle kreft biomarkører, slik som PSA til prostatakreft, er blitt anerkjent after flere tiår med kliniske implikasjoner en. Til å begynne med PSA ble foreslått for diagnostisering og behandling av adenokarsinom av prostata 11. Det sistnevnte ble foreslått for cancer screening og å følge utviklingen av sykdommen 12.. Men det er fortsatt et spørsmål som er jevnlig spurte: "hvordan å bruke PSA '. (I) En grå sone tilsvarer en konsentrasjon i serum av 2,5-10 ng / ikke ml ikke tillate en klar forskjell gjøres mellom kreft og noncancer 2, (ii) to store kohortstudier melde hundretusener av mennesker i Europa og USA ikke klarte å komme til en klar konklusjon om nytten av screening i form av sykdomsspesifikk dødelighet 13,14, (iii) analyse av postoperative PSA kinetiske parametre som PSA klaring, PSA velocity og dobling tid, men enkel i teorien, kan utgjøre betydelige utfordringer i praktisk anvendelse 3,4. Vi kan forvente at i de kommende årene, biomarkør applications vil støtte en klinisk valg mellom vaktsom venter og mer eller mindre aggressiv behandling avhengig av tumor fenotype. Når det gjelder diagnosen gjengis av patolog, kommer en første begrensende faktor fra en 20% falsk negativ diagnose innen prostatabiopsier (mange kreftformer er savnet etter prøvetaking). Et annet problem dreier seg om behovet for en ekstra biopsiprosedyre etter en negativ, noe som kan medføre skadelige virkninger.
Radikal prostatektomi er i dag en av de standard behandling for prostatakreft. Det er foreslått hos friske pasienter, aldring 45-65 år, særlig i tilfelle av aggressive mønstre (Gleason 7 til 10), multifokal tumor eller følbar tumor. Det er nå gjort i vår avdeling ved hjelp av robotassistert kirurgi. På grunn av den økende bevis for at molekylære markører vil ha avgjørende betydning i de kommende årene, har vi besluttet å foreslå for alle våre pasienter mulighet til å delta i et program for prostatavev bank. Mer presist, har de ekspanderende molekylære forskningsprogrammer på prostatakreft resultert i et økende behov for tilgang til høy kvalitet frisk tumorvev fra prostatektomi prøver. Denne forskning, særlig de genomiske nærmer seg, kreves store prøver med høy DNA / RNA kvalitet. Tumoral og tilgrensende 'ikke-tumoral' vev fra den samme pasienten er nødvendig. Anbefalinger for håndtering og behandling av radikale prostatectomies er utformet for å bevare patologiske funksjoner som bestemmer scenen og margin status og dermed potensial videre behandling og prognose. Enhver frisk vev utvalgsmetode, derfor bør ikke gå på akkord påfølgende patologiske undersøkelser for å være akseptabel for diagnosen. Makroskopisk disseksjon av prostata er vanskelig og stor oppmerksomhet må rettes mot margin vev og kapsel invasjon: noen disseksjon for prostata bank bør alltid utføres av en utdannet uropathologist henhold til en avtaled protokollen. Den etiske komiteen av det medisinske fakultetet og staten medisinske utvalget enige om å disse undersøkelsene og informert samtykke ble innhentet for alle pasienter inkludert i prostata vev bank.
I løpet av de siste 10 årene, har de fleste av forsøkene for Herv uttrykk måling brukes RT-PCR teknikker enten å fokusere på en bestemt locus 20-24 eller basert på den relative bevaring av pol gener å evaluere generelle trender innenfor Herv slekter 25,26 . I tillegg PCR presiseringer som bruker svært degenererte primere kombinert med lav tetthet mikromatriser ment å oppdage og kvantifisere uttrykk for Herv familier 27,28. For å spore uttrykk for enkelte locus innen en familie, tilnærminger basert på PCR forsterkning av konserverte regioner kombinert med påfølgende kloning og sekvense aktivert transcriptionally aktive distinkte elementer av HML-2 29,30 eller Herv-E4.1 31 familier til bli identifisert. Også slutter ved kloning og sekvense trinn, genomet gjenta uttrykket overvåking teknikk som mål å identifisere arrangører blant gjentar identifisert aktive HML-to spesifikke menneskelige ensomme Ltrs <sup> 32,33. Vi suksessivt utviklet to generasjoner av høy tetthet mikromatriser dedikert til analyse av Herv transkriptom, innføring av metoder som er egnet for gjentatt element probe utforming for å minimalisere kryssreaksjoner mellom Paraloge elementer innenfor en familie 34,35. Den Herv-V2 chip som retter seg mot 2690 forskjellige provirus og 2883 solo Ltrs av Herv-W, Herv-H, Herv-E 4.1, Herv-FRD, Herv-K HML-2 og Herv-K HML-fem familier, avduket ekspresjon av 1718 Herv loci (figurene 7A og B) i et bredt spekter av vev 35, som er illustrert i dette dokumentet ved identifisering av putative prostatakreft biomarkører. I tillegg er bruk av flere probesets på et gitt locus informative om dets transkripsjonsregulering. Først en U3 negativt signal i forbindelse med en U5 positiv en klassifiserer LTR som en promotor, og omvendt U3 U5 positive og negative signaler kan gjenspeile en polyadenylerings rolle. Dermed har vi identified 326 promoter Ltrs i et bredt spekter av vev 35 og, basert på dette U3-U5 dichotomous informasjon gitt av matrisen, vi foreslått og eksperimentelt bekreftet for noen utvalgte saker som for eksempel autonome transkripsjon ble kontrollert av en metylering avhengig epigenetisk prosess 34 (Figur 8). For det andre, påvisning av signaler fra f.eks LTR, gag og env uavhengige probesets eller utstedt fra prober rettet spesifikt spleise krysset er informativ om proviral spleising strategi, som illustrert ved den ERVWE1/Syncytin1 uttrykk profil i morkaken eller i svulst testikkel 34. Dette tyder på at prosessen med Herv spesifikk probe markering er robust nok til å tåle identifisering av vev-tilknyttet skjøting strategi, så effektivt som for konvensjonelle gener 36 (figur 8).
Denne fremgangsmåten er det første forsøk på å identifisere individuelt Herv locus ekspresjonved hjelp av en tilpasset høy tetthet microarray basert på Affymetrix teknologi. De klart identifisert fordeler av microarray format å dechiffrere Herv transcriptome bestående av (i) den koordinerte utforskning av flere Herv familier og (ii) den samtidige og uavhengige analyser av de ulike regionene for hvert locus, f.eks. U3 og U5 domener for solo og proviral Ltrs, gag eller env regioner og mulige skjøtes veikryss forbundet med proviral strukturer, uten a priori på funksjonaliteten til Herv element. Utsiktene stole på en forbedring av merknader i microarray-forbundet biocomputing verktøy. Dette bør tillate en å konvertere chip signaler til biologiske hypoteser som for eksempel om dokumentert aktive HERVs kjøre lncRNA transkripsjon eller modulere mer eller mindre proksimale koding genuttrykk. Faktisk er en slik antagelse støttes av nyere studier som identifiserte prostata kreft-assosiert ncRNA transkripsjoner inneholder komponenter av viral ORF'er fra Herv-K endogene retrovirus familien eller deler av en viral LTR promoter region 37, samt to genet fusion hendelser nemlig Herv-K22q11-ETV1 og Herv-K17-ETV 38,39. Til sammen kan dette hele transkriptom tilnærming kombinert med LTR funksjon og spleise strategi identifikasjoner bidra til å dechiffrere markør versus trigger komponenter av Herv uttrykk i kronisk 40,41 og infeksjonssykdommer 42,43.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali JAILLARD og Bertrand Bonnaud for deres bidrag til den første utvikling og optimalisering av Herv-V2-protokollen. Vi ønsker også å takke Hader Haidous for hans veiledning på etiske hensyn.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |