Funktionel Interrogation Adult Hypothalamus Neurogenese med Focal Radiological Hæmning

Summary

Funktionen af ​​pattedyr neuroner voksen-fødte er fortsat et aktivt område af undersøgelsen. Ioniserende stråling hæmmer fødslen af ​​nye neuroner. Ved hjælp af computer tomografi-guidede omdrejningspunkt bestråling (CFIR), kan tre-dimensionelle anatomisk målretning af specifikke neurale progenitorpopulationer nu bruges til at vurdere den funktionelle rolle af voksne neurogenese.

Abstract

Den funktionelle karakterisering af voksne født neuroner fortsat en stor udfordring. Tilgange til at hæmme voksen neurogenese via invasive viral levering eller transgene dyr har potentielle confounds der gør fortolkning af resultater fra disse undersøgelser vanskelig. Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at noninvasively undersøge funktionen af ​​udvalgte grupper af voksne-fødte neuroner gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Focal ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner og tillader målretning af specifikke neurale progenitor regioner. For at belyse den potentielle funktionelle rolle, at voksne hypothalamus neurogenese spiller i reguleringen af ​​fysiologiske processer, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af ​​voksen-fødte neuroner i hypothalamus median eminence. Vi beskriver en metode til C omputer tomografi-vejledtf ocal ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis og nøjagtig anatomisk målretning i små dyr. CFIR bruger tre-dimensionelle volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af den strålingsdosis, minimerer bestråling nontargeted områder af hjernen, og giver mulighed for konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Denne protokol tillader en at stille spørgsmål om funktionen af ​​voksen-fødte neuroner, men åbner også områder til spørgsmål omkring radiobiologien, tumor biologi og immunologi. Disse radiologiske værktøjer vil lette oversættelsen af ​​opdagelser på bænken til sengekanten.

Introduction

Nylige opdagelser har vist, at pattedyrs hjerne voksen kan undergå en bemærkelsesværdig grad af plasticitet. Voksen-fødte neuroner er genereret gennem hele voksenlivet i specialiserede nicher af pattedyrhjernen ^1.. Hvad er funktionen af ​​disse voksen-fødte neuroner? Og så meget mere, de spiller en rolle i fysiologi og adfærd? Undersøgelser om dette emne har traditionelt fokuseret på subventricular zone af de laterale ventrikler og subgranular zone af hippocampus, men de seneste undersøgelser har karakteriseret neurogenese i andre områder af hjernen, såsom pattedyr hypothalamus ^2. Neurogenese er blevet rapporteret i den postnatale og voksne hypothalamus ^2-10, og funktionen af disse nyfødte hypothalamus neuroner forbliver et aktivt område af undersøgelsen.

Den funktionelle karakterisering af voksen-fødte neuroner er fortsat en stor udfordring for neurovidenskab felt i almindelighed. Selektiv hæmning af specIFIC neurale progenitorpopulationer fortsat begrænset af manglen på tilgængelige molekylære markører, der er unikke for enlige neurale progenitorpopulationer ^11. Derfor er det stadig svært selektiv sletning af voksen-fødte neuroner fra disse neurale stamfædre via genetisk målretning. Ligeledes viral levering at målrette voksen-fødte neuroner lider potentielle konfoundere såsom indførelse af skader og betændelse i miljøet ^12..

Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at omgå disse forvirrer og undersøge disse spørgsmål gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner, og tillader en ikke-invasiv metode til at målrette neurale progenitorpopulationer ^13-15. For nylig beskrev vi et germinale region af pattedyr hypothalamus median eminence (ME), vi betegnes hypothalamus proliferative zone (HPZ) ^2. </sup>. Vi fandt, at når unge voksne hunmus fik en fedtrig kost (HFD), niveauer af neurogenese i HFD-fodret mus var væsentligt højere end deres normale chow (NC) fodret kontrol på dette ME region ^2. For at teste om voksen neurogenese inden hypothalamus ME regulerer stofskiftet og vægt, vi søgte at forstyrre denne proces. Medianen eminence er en lille ensidig struktur på bunden af ​​tredje ventrikel, hvorfra regulerende hormoner, der frigives. For at hæmme proliferation og efterfølgende neurogenesis uden at ændre de andre fysiologiske funktioner i dette område af hjernen, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af nyfødte voksne neuroner i hypothalamus median eminence ^2.

En række grupper har ansat stråling at undertrykke neurogenesis i kanoniske regioner ^14-28. Imidlertid har tidligere radiologiske tilgange generelt målrettet store områder, eller oftenn utilsigtet også målrettet flere områder i hjernen, hvor neurogenese er blevet rapporteret, hvilket gør det vanskeligt entydigt at knytte eventuelle adfærdsmæssige defekter observeret med defekter i specifikke neurale progenitorpopulationer. Muligheden for mere målrettet bestråling leveres af radiologiske platforme, der kombinerer c omputer tomografi-guidet billeddannelse med f ocal stråle ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis anatomisk målretning ^29-36. Stråling bjælker så små som 0,5 mm i diameter er til rådighed til at målrette specifikke neurale progenitorpopulationer ^35. Denne metode giver os mulighed for at målrette hypothalamus ME og arrestere spredning og blokere neurogenesis i små dyr. Efter radiologisk behandling på disse progenitorpopulationer kan fysiologiske og adfærdsmæssige test skal udføres for at belyse den potentielle funktion af voksne-fødte celler. Focal målretning er især vigtigt for vores ansøgning sidenhypofysen ligger tæt på hypothalamus median eminence, bestråling af hypofysen kan påvirke hormonal funktion og efterfølgende forvirre resultaterne.

Det biologiske grundlag for undertrykkelse af neurogenese efter bestråling stadig uklart. Tidligere stråling undersøgelser har påberåbt sig stort område bjælker, og har konkluderet, at undertrykkelsen af neurogenese er medieret gennem en inflammatorisk reaktion ^{14, 37..} Som sådan er det uklart, om meget fokal bestråling kunne undertrykke neurogenese, da det ikke fremkalde en betydelig inflammatorisk reaktion. Imidlertid har nyere undersøgelser fra vores gruppe af den klassiske neurogen region i hippocampus vist, at meget fokal bestråling med en dosis på 10 Gy kan undertrykke neurogenesis i mindst 4 uger efter bestråling ^35.

At afhøre funktionen af ​​voksen-fødte hypothalamus neuroner i median eminence, bruger vi en præcision stråling device stand til at levere CT-scanning i kombination med lille diameter stråling bjælker til at inhibere ME neurogenese. Ved hjælp af en røntgen-rør fastgjort til en portalkran, der roterer over et område på 360 ° vi leverer bue-formede mikro bestråling stråle med anvendelse af et robotstyret prøvebordet, der tillader drejning af et dyr under strålebehandling (figur 1) . En høj opløsning røntgen-detektor anvendes til at erhverve billeder, når gantry er i vandret position ^33. Til denne undersøgelse blev CT-billeder rekonstrueret med en isotropisk voxelstørrelse på 0,20 mm. On-board CT-scanning tillod identifikation af et mål, mens dyret er i behandlingen position. Målet blev lokaliseret ved hjælp af CT-navigation dosis-planlægning software, der var inkluderet i vores kommercielt tilgængelige radiologisk platform. Efter at lokalisere vores ROI ved CT-scanning, blev dyret flyttet til den rette behandling stilling ved robot modellen fase, der har fire degRees frihed (X, Y, Z, θ). Gennem en kombination af gantry og robot fase vinkler, kan bjælker leveres fra næsten en hvilken som helst retning i forhold til dyret, og stereotaktiske bue-lignende behandlinger er mulige ^29. For disse og alle andre billeddannende undersøgelser blev mus anbragt i et immobilisering enhed, der tillader levering af bedøvelsesmiddel isofluran gas, mens begrænse bevægelse. Immobiliseringsprocessen seng er CT-kompatibel og tilsluttes til den robot modellen trin ^34..

Vi forventer, at CFIR vil give konceptuelle fremskridt på en række forskningsområder. Selvom vi bruger radiologisk målretning af hypothalamus median eminence som bevis på princippet om denne teknik, kan CFIR bruges til at målrette en region af kroppen af ​​enhver lille model organisme i princippet. I neurovidenskab, for eksempel, vi forestiller denne teknik kan bruges til at vurdere funktionen af ​​aktivt proliferative progenitorpopulationer der er blevet foreslået til eksistet andre circumventricular organer, såsom området postrema ^{38, 39,} subfornikale organ ⁴⁰ og hypofysen ^41. Langvarige kontroverser om den funktionelle rolle af voksne neurogenese og identificere en kausal rolle i adfærd kan nu også blive bedre behandlet. I sangfugl kan denne teknik omhandle den rolle af voksne neurogenese i at bevare den robuste og sæsonbetonede adfærd fuglesang ^42, som har været hæmmet af evnen til selektivt at hæmme neurogenesis i bestemte områder af hjernen. Forståelse denne robuste adfærdsmæssige model kan kaste ny indsigt i den rolle, voksne neurogenese i reguleringen af ​​andre seksuelt dimorfe adfærd. Alternativt i den metaboliske område CFIR kan anvendes til at undersøge aspekter af den rolle af hepatocytproliferation og dens rolle i stofskiftet og energibalance. Muligheden for konceptuelle fremskridt i flere forskningsdiscipliner forstærkes af indførelsen af ​​denne teknik.

<p class= "Jove_content"> I dette papir, vi demonstrere mulighederne CFIR til præcision anatomisk målretning af et samlingspunkt bestråling stråle. Selvom vi oprindeligt udviklet denne lille dyr stråling forskningsplatform (SARRP) for vores studier, er andre lignende enheder nu kommercielt tilgængelige, der kan udføre lignende CT-vejledt omdrejningspunkt bestråling ^{43, 44.} Derfor har vi generalisere denne CFIR protokol med trin, der kræves for alle forsknings-platforme snarere end dem, der er specifikke for SARRP. Fordelene ved CFIR end tidligere radiologiske fremgangsmåder til at inhibere neurogenese er, at denne teknik tillader tredimensionel volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af dosis konform dosis minimerer udsættelse for nontargeted hjerneregioner, og høj præcision stråle geometri tillader konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Vi skitsere, hvordan at bruge CT-vejledt imaging at målrette dosis til en specifik anatomisk region, og ved at gøre det, hvordan man kan visualisere strålingdosisfordeling direkte i væv ved hjælp af immunhistokemisk farvning for γ-H2AX, en markør af DNA dobbelt-strenget pauser ^{35, 45-48.} Brugen af ​​denne metode til selektiv bestråling af neurogene nicher kan have betydelige konsekvenser afsløre funktionelle rolle af nye voksen-fødte neuroner på fysiologi og sygdom.

Protocol

Animal Brug Indhente godkendelse fra institutionelle Animal Care og brug Udvalg for standard pleje og brug protokoller. Den nuværende protokol blev udviklet til fokale bestråling undersøgelser 5,5-10 uger gamle voksne C57BL6 / J-mus, som tidligere beskrevet (figur 2) 2. Men andre aldre og kan også bruges mindre dyrearter (rotter, hamstere, jorden egern, osv.), forudsat at effektive anæstesi protokoller og en radiografiske referencepunkter atlas muliggø…

Representative Results

Vurdere CT-vejledt målretning og Nøjagtighed Den mekaniske kalibrering af systemet er kritisk for at sikre, at stråler fra forskellige vinkler alle skærer hinanden i et enkelt punkt. Kalibrering blev udført med en halvautomatisk imaging-baserede metode, hvor ende-til-ende tilpasning nøjagtigheden er blevet målt til at være 0,2 mm 29. Denne nøjagtighed er yderst kritisk, da mængden af hypothalamus median eminence struktur er lille 2. For at teste denne kalibrering…

Discussion

CT-vejledt omdrejningspunkt bestråling (CFIR) er et nyt og komplet system tilgang stand til at levere strålingsfelter til mål i små dyr under robot styring med CT-vejledning ^32. Evnen til CFIR til at levere meget fokuseret bjælker til små dyremodeller giver nye forskningsmuligheder at bygge bro laboratorium forskning og klinisk oversættelse. Dette papir beskriver CFIR tilgang til præcis stråling levering til specifikt at målrette en hypothalamus neural progenitorpopulationen. Vi viser her, hvordan m…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
SARRP research platform	Xstrahl	RS225A	http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker	Xstrahl		Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film	IPS	GAFchromic ETB2
Mouse phantom	Gammex	457	Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody	Millipore, Inc.	05-636	clone JBW301
High-fat rodent diet	Research Diets	D12492i	60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	10019-360-40
0.01 M Sodium citrate	Fisher Scientific		1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
DAPI	Fisher Scientific		nuclear counterstain
Mounting medium	Fisher Scientific		Vectashield or Gelvatol is preferred