Method Article

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי במבחנה באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

DOI:

10.3791/50741

⸱

October 22nd, 2013

 ,  ,  , 
1Faculty of Infectious & Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע מבחני תרבית תאים לחקירת הידבקות ופלישה חיידקים בתנאים אירוביים הוא בדרך כלל בלתי מייצג של In vivo איכות סביבה. מודל קאמרי דיפוזיה אנכית מאפשר מחקר של אינטראקציות של הפתוגן האנושי קמפילובקטר jejuni עם תאי אפיתל במעי תחת יותר In vivo תנאים, וכתוצאה מפלישת חיידקים משופרת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. פיתחנו מודל חוץ גופית בזיהום המאפשר coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז בינוני ושונה. לשכת דיפוזיה אנכית (VDC) מודל מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בתנאים של רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יהיה מסופק עם חמצן מזרם הדם. הצבת מקוטבת סלולרי (IEC) monolayers אפיתל במעי גדלה במוסיף Snapwell לVDC יוצרת תאי apical וbasolateral נפרדים. תא basolateral מלא בתרבית תאים בינונית, אטום וperfused עם החמצן whilst תא הפסגה מלא במרק, כל הזמן פתוח וטופחו בתנאי microaerobic. יכול להישמר גם קאקו-2 וT84 IECs בVDC בתנאים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה על הישרדות תא או שלמות שכבה. ניסויי Coculturing הופיעו עם ג שונה זני הבר מסוג jejuni וקווים שונים של חברת חשמל במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה לגרום reproducibly בעלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) והתאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות 1. הסביבה שנוצרה במודל VDC מחקה את הסביבה נתקל על ידי C. באופן הדוק יותר jejuni במעי האנושי, ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים באופן הדוק יותר במציאות vivo. אנו מציעים כי השימוש במודל VDC יאפשר פרשנויות חדשות של יחסי הגומלין מתערבתWeen חיידקים פתוגנים ותאי מארח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. באמצעות מבחני כאלה סלולריים תרבות, הידבקות חיידקים לתאי מארח, זיהוי של קולטני תא מארח, תא מארח מסלולי איתות ופלישת חיידקים של תאי מארח כל נחקרו בפירוט, וכתוצאה מתצפיות רבות וחשובות. עם זאת מבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצע בתנאים אירוביים כי לא יכול להיות נציג בסביבת vivo. מגבלה עיקרית של שימוש במודלים חוץ גופית ללמוד זיהומים במערכת העיכול היא שתנאי תרבות רמות חמצן גבוהים, כולל בדרך כלל מעדיפים הישרדות תא אוקריוטים. עם זאת תנאים בחלל המעי יהיו כמעט אנאירובי. פתוגנים מעיים בסביבת חמצן נמוכה מאוד לבטא גנים ארס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צמיחה של חברת החשמל monolayers על 0.4 מיקרומטר מסננים מיוחדים

  1. -2 קאקו תרבות תאים בתקשורת של Dulbecco חיוני שונה (DMEM) בתוספת 10% (V / V) עוברי עגל בסרום, 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ​​100 ו 1% (V / V) חומצות אמינו חיוניות ב סטנדרטי תרבות רקמות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו 95% אוויר. זרע 4 x 10 5 קאקו-2 IECs ל0.4 מיקרומטר לסנן ולגדול לקיטוב מעל 21 ימים, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים.
  2. מדוד את TEER כדי לאשר מצב קיטוב של monolayer באמצעות מד התנגדות וולט ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויי Coculturing הופיעו עם ג זן פראי סוג jejuni וIECs במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה הראו עלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) ותאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות בזמן אופן תלוי 1. תצפית זו הייתה לשעתק באמצעות שני ג שונה זני jejuni פראי מסוג (11168H ו81-176) ושני קווים שונים (חברת חשמל קאקו-2 ו T84), המדגיש את תקפותו של מודל VDC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה כדי לחקור את יחסי הגומלין של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח הוא טכניקה מועסקות באופן נרחב במעבדות מחקר רבות. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. שימוש נרחב במודלים של זיהום מבחנה אינן מתאימים במיוחד ללימוד ג microaerophilic jejuni בהשוואה לפתוגנים מעיים אחרים, כי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו מה למסור.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דומיניק מילס נתמכה על ידי בלומסברי מכללות PhD Studentship (2007-2010). המחברים מבקשים להודות לשניהם Gundogdu האוזן ועאבדי Elmi על סיועם בפיתוח מודל VDC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מערכת דיפוזיה אנכית מיוחדת לשימוש עם מוסיף Snapwellמכשיר הרווארד66-0001סעפת ושישה תאי Snapwell
כובעיםמנגנון הרווארד66-0020
טבעות Oמכשירי הרווארד66-0007
מהדקיםמכשירי הרווארד66-0012
מסנני Snapwell (גודל נקבוביות 0.4 μ מ)קורנינג Costar3407
Millicell ERS-2 וולט-אוהם מד התנגדותMilliporeMERS00002
ספקטרופוטומטר WPA Lightwave IIBiochrom80-3003-72

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
  2. Marteyn, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enteric Bacterial InvasionIntestinal Epithelial CellsVertical Diffusion ChamberIn Vitro InfectionBacterial Host InteractionMicroaerobic ConditionsCaco 2 CellsCell Culture AssayBacterial EnumerationGentamycin Protection Assay

Related Articles