De embryonale epidermis af meget sent Drosophila embryoner giver et in vivo system for hurtig analyse stiksår respons og kan kombineres med genetiske manipulationer eller kemiske mikroinjektion behandlinger til at fremme studier i sårheling til oversættelse til pattedyr modeller.
Drosophila foster udvikler en robust epidermal lag, der tjener både til at beskytte de interne celler fra en barsk ydre miljø samt at opretholde cellulær homeostase. Stikskade med glas nåle giver en direkte metode til at udløse en hurtig epidermal viklet reaktion, der aktiverer sår transkriptionelle reportere, der kan visualiseres ved en lokal reporter signal i levende embryoner eller larver. Punktering eller laser skade giver også signaler, der fremmer rekrutteringen af hæmocytter til såret site. Overraskende, svær (igennem) stikskade i embryoer sene kun sjældent forstyrrer normal fosterudvikling, da mere end 90% af disse sårede embryoner overleve til voksenalderen, når embryoner injiceres i en olie medium, der minimerer øjeblikkelig lækage af hæmolymfe fra punktursteder . Såret procedure kræver mikromanipulering af Drosophila embryoner, herunder manuelle tilpasning af embryonerne på agar plader og overdragelse af de justerede embryoner til objektglas. Drosophila-epidermal såret respons assay tilvejebringer et hurtigt system til at teste de genetiske krav til en række biologiske funktioner, der fremmer sårheling, samt en måde at screene for potentielle kemiske forbindelser, der fremmer sårheling. Den korte levetid og nem dyrkning rutine gør Drosophila en kraftfuld model organisme. Drosophila ren sårheling synes at koordinere epidermal regenerative respons, med medfødt immunrespons, på måder, der stadig er under efterforskning, som giver et glimrende system til at finde conserved regulerende mekanismer fælles for Drosophila og pattedyr epidermal såring.
Manipulation af Drosophila-embryoner ved et mikroinjektion teknik er en veletableret assay 1. Betydningen af epidermal såret respons reporter metode er at kombinere protokollen for punktering / mikroinjicering med fluorescerende journalister og visualisere et in vivo respons på epidermal skade i Drosophila embryoner. Målet med denne metode er at muliggøre et bredere sæt af forskere til at bruge Drosophila som et redskab til at undersøge de processer, der regulerer transkriptionel respons på epidermal stikskade. De enkelte lag epidermis i Drosophila giver et simpelt system til at studere en epidermal sår reaktion efter en punktering skade 2. The Drosophila embryo er en robust modelsystem til genetisk dissekere stadier af sårheling, herunder sår reaktion, inflammation og reepitelisering 3. Dette er til dels fordi mange eller de fleste zygotiske mutanter overlever til slutningen af embryogeneser og udvikle epidermale barrierer, selv når udviklingsmæssige mønster går dybt skævt. Forrige karakterisering af en velbevaret transskription faktor Kornet hoved (GRH), identificeret som GRH-target gener dopadecarboxylase (DDC) og tyrosinhydroxylase (PLE) transkriptionelt aktiveres omkring de steder i skade 4.. Drosophila som model organisme til sår svar giver en supplerende linje af undersøgelse for at fremme undersøgelser i pattedyr sårheling 5.. Efterfølgende undersøgelser har identificeret yderligere Drosophila sårinduceret gener og udviklet en "værktøjskasse" af mange fluorescerende sår journalister at overvåge in vivo epidermal sår reaktion til at rense såret 6. Nylige rapporter om regulering af Drosophila sårheling har fokuseret på sårlukning fænotype, så opdagelsen af mange veje, der regulerer celle migration 7,8. Med analysen affluorescerende sår reportere, har vores studier identificeret en roman sæt af gener, der kræves for den lokaliserede udtryk for epidermale afviklede inducerbare gener 9. En af fordelene ved såret respons reporter metode er, at resultaterne giver mere indsigt i en mekanisme for, hvordan signaler transduceres fra skadestedet til de omkringliggende celler. Men en skadevirkningen af såret respons reporter metode er, at resultaterne ikke direkte linke til fænotyper i sårheling eller reparation. Bredere anvendelse af den rene sår punktere protokol i genetiske og kemiske skærme vil give nye regulatorer af transkriptionel respons på epidermal såret at blive identificeret og fremme oversættelse af sårheling opdagelser i mammale modeller af skade behandlinger.
En øjeblikkelig transskriptionsregulerende reaktion på ydre signaler tillader celler til at koordinere en lokal reaktion på ekstracellulære stimuli, hvilket kan omfatte stress, skade eller infektion. Den forkerte kontrol af en lokaliseret reaktion kan have skadelige virkninger på de omkringliggende celler, såvel som et spild af ressourcer at reparere skaden. Drosophila embryo giver et glimrende system til at udføre grundlæggende sår healing eksperimenter i en billig og nem at vedligeholde model organisme. Potentialet for samarbejde mellem forskning i andre modelorganismer og Drosophila giver en unik mulighed for at udforske mange biologiske spørgsmål.
En yderligere teknik de viklede reportere er det genetiske kombination af mutant baggrunde, der giver en effektiv metode til afprøvning af bidrag af nye gener til aktivering af den epidermale såret respons pathway. Vi har epidermal sårinduceret transcriptionale reportere available på både 2. og 3. kromosomer 5. I denne undersøgelse bruger vi UAS og GAL4 systemer overekspression 16. I undersøgelser med dødelige mutantalleler vi bestemme den genetiske baggrund ved hjælp af et fluorescerende balancer kromosom, fx Krüppel-GFP 17. Vi har analyseret såret reporter lokalisering i flere genetiske baggrunde (Tabel1).
En eventuel ændring af teknikken er at kombinere mikroinjektion og sårdannelse. Mikroinjektion kan anvendes til at indføre en kemisk opløsning i embryoet. Adskillige kemiske forbindelser er blevet testet og fundet til at regulere aktiviteten af epidermal viklede reportere 9. Denne metode til samtidig sårdannelse og mikroinjektion kan være nyttigt til at øge antallet af celler i Drosophila embryo, der reagerer et sår signal og kan anvendes direkte til at overvåge genekspression ændringer efter sårdannelse 18. En fremtidig anvendelse af mikroinjektion teknik vil være at teste nye kemikalier til regulering af epidermal såret respons.
Drosophila som model for genetiske undersøgelser tilbyder en bred vifte af simple protokoller til effektivt at behandle komplekse spørgsmål. Nylige rapporter om mulighederne for Drosophila teknikker fremhæver brugen af hemocyte migration 19 og parasitære hveps infektion 20 som et middel til yderligere at udvide virkningerne af Drosophila forskningsverdenen. I tillæg til sårheling studier giver Drosophila en klassisk model for regenerering med fantasiens disksystem 21,22. De kombinerede fremskridt i imaginal disc regenerering studier og punktering / mikroinjektion såret giver en glimrende system til at opdage velbevarede dele af væv reparation.
The authors have nothing to disclose.
Denne protokol er blevet udviklet i samarbejde med tidligere medlemmer af McGinnis Lab, Kim A. Mace og Joseph C. Pearson. Vi takker de fortsatte bestræbelser fra Bloomington Drosophila Stock Center for deres arbejde med at organisere og distribuere værdifulde bestande. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health (R01 GM077197 og K12 GM68524) og familien af Herbert Stern. MTJ understøttes i øjeblikket af Grant Number 5G12RR003060-26 fra National Center for Forskning Ressourcer og Grant Number 8G12MD7603-27 fra National Institute on Minority Sundhed og Sundhed forskelle. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institute on Minority Sundhed og Sundhed forskelle eller National Institutes of Health.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |