Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Summary

Med effektorfunktioner skilda från andra T-cellgrupper, har Th17 celler varit centralt inblandad i inflammatoriska autoimmunitet. Denna in vitro Th17 differentiering protokollet ger en möjlighet att avgöra om naiva CD4 + T-lymfocyter kan differentiera till Th17 celler, och för att ytterligare undersöka deras roll i autoimmunitet och värdsvar.

Abstract

Th17 celler är en distinkt undergrupp av T-celler som har befunnits producera interleukin-17 (IL-17), och skiljer sig i funktion från de andra T-cellundergrupper inklusive Th1, Th2, och reglerande T-celler. Th17 celler har dykt upp som en central boven i nitiska inflammatoriska immunsvar i samband med flera autoimmuna sjukdomar. I denna metod renar vi T-lymfocyter från mjälte och lymfkörtlar från C57BL / 6 möss, och stimulera renade CD4 + T-celler under kontroll och Th17-inducerande miljöer. Den Th17 framkallande miljö omfattar stimulering i närvaro av anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar, IL-6 och TGF-β. Efter inkubation under minst 72 timmar och upp till fem dagar vid 37 ° C, är cellerna därefter analyseras för förmågan att producera IL-17 genom flödescytometri, qPCR och ELISA. Th17 differentierade CD4 + CD25-T-celler kan användas för att ytterligare belysa den roll som Th17 celler spelar i uppkomsten och utvecklingen av autoimmunitet och värd defense. Dessutom kan Th17 differentiering av CD4 + CD25-lymfocyter från olika musmodeller knockout / sjukdoms bidra till vår förståelse av cellens öde plasticitet.

Introduction

CD4 + T-lymfocyter (T-celler) spelar en kritisk roll i immunsystemet medierad försvar mot infektiösa mikroorganismer. Omvänt är T-celler också intimt förknippat med uppkomsten och utvecklingen av autoimmuna sjukdomar som typ 1-diabetes, systemisk lupus erythematosus, och reumatoid artrit. CD4 + T-lymfocyter blir aktiverade genom en kombination av T-cellsreceptor (TCR) interaktioner med besläktade antigen / MHC II (MHCII) molekyler, och CD28-receptorinteraktioner med B7.1/B7.2 ligander ^15. Förutom tillhandahållandet av TCR-stimulering och CD28-samstimulering, antigenpresenterande celler ger också en cytokin miljö, som bestämmer differentier tillstånd av T-lymfocyten, därigenom rikta T-lymfocyt-svar på det givna antigenet. Tydlig patogen / antigenpresenterande cell interaktioner skapar distinkta cytokin miljöer, som skeva T lymfocyter ner skilda vägar fokuserade på Eliställandet av den initierande patogenen. Tyvärr, T-lymfocyter effektor vägar, som ursprungligen utformats för att utrota invaderande patogener, kan felaktigt riktas mot själv vävnader ^15. Därför är avgörande för vår förståelse av hur man kan modulera balansen mellan elimineringen av patogener och tolerans att själv bättre förståelse för varje distinkt CD4 + T-cell delmängd s differentieringstillstånd.

Förutom den Th1, Th2, och inducerbara regulatoriska T-celldifferentieringsvägar, kan naiva T-lymfocyter också drivas av cytokiner nerför Th17 reaktionsväg. Skäl Th1 celler strids intracellulära patogener, eliminera Th2-celler extracellulära patogener, och reglerande T-celler (Tregs) minimera inflammatoriska svar ^{1, 16;} Th17 celler spelar en viktig roll när det gäller att eliminera extracellulära bakterier och svampar. Th17 celler är allmänt betecknad med expression av härstamning specifik transkriptionsfaktör RORγT och produktion av IL-17A, som främjar aktivering av makrofager och neutrofiler ^{1, 7.}

Th17 celler har implicerats i flera autoimmuna sjukdomar, med ingående gnagarmodeller. Till exempel har det visats att IL-23 (som krävs för att upprätthålla den Th17 fenotyp), men inte IL-12, var den centrala gärningsmannen i experimentell autoimmun encefalit (EAE), modellen gnagare sjukdom för MS. Det har senare visat sig att minskning av IL-17 produktion är korrelerade till EAE förebyggande ^{2, 6, 17.} Dessutom har Th17 celler förknippats med andra autoimmuna sjukdomar, bland annat artrit och systemisk lupus erythematosus (SLE) ^{10, 16.} IL-23 brist p19 ^{– / –} möss visade sig ha mycket låga antal av Th17-celler, och är resistenta mot att utveckla inte bara EAE, men även kollagen-inducerad artrit, en modell för reumatoid artrit ^{10, 18.} Dessutom möss som behandlats med neutraliserande IL-17A-antikroppar aftER uppkomsten av kollagen-inducerad artrit befanns också ha resolution av ledskada ^18. Det bör noteras att den roll som Th17 celler i förloppet av autoimmun sjukdom återstår att karakteriseras som senare forskning har också visat en skyddande roll av Th17 celler i typ 1-diabetes ^{9, 11} och tarminflammation ^14. Dessa studier bekräftar vikten av Th17 differentiering i autoimmunitet.

In vitro Th17 differentiering är en nödvändig metod i T-cellsforskning för att det finns åtminstone två förbryllande frågor som kräver ytterligare undersökning: 1) Hur exakt gör IL-6 reglerar balansen mellan Treg och Th17 differentiering, och 2) vad är de exakta mekanismerna bakom IL-17-inducerad inflammationssjukdomar? Vår metod använder CD4 + CD25-T-celler från mjälte och lymfkörtlar hos C57BL / 6 mus. Det är viktigt att notera att även om det är möjligt att inducera Th17 differentiering med användning av en orenbefolkning, skaffa åtminstone en 80% ren CD4 + CD25-T-cell population förnekar några bekymmer för förorening och säkerställer mer framgångsrika Th17 differentiering resultat. För att uppnå korrekt Th17 differentiering, är CD4 + CD25-T-celler inkuberades i närvaro av anti-CD3 och anti-CD28, som tillhandahåller aktiveringssignaler, 1 och 2, respektive, och IL-6 och TGF-β. Även om det har rapporterats att IL-23 i sig kan användas för att uppnå Th17 differentiering visade det senare visat att IL-23 är nödvändiga för stabiliteten av Th17 cellpopulationen, men IL-6 och TGF-β är väsentliga för Th17 differentiering ^{3, 18, ​​19.} Murina studier har visat att IL-23-receptor uttrycks på CD4 +-T-celler endast efter att de har stimulerats med IL-6 och TGF-β ^{13, 18.} Dessutom kommer celler Th17 framgångsrikt utvecklas i närvaro av IL-23-blockerande antikroppar, så länge som IL-6 och TGF-β är närvarande ^{18, 19.} Som sådan här Th17 differentiering protokoll provIdes de rätta förutsättningarna för att lyckas förmå Th17 differentiering. Utveckling av en bättre förståelse av de mekanismer som ligger bakom Th17 differentiering och IL-17 produktion presentera möjligheten för utveckling av bättre terapier som syftar till autoimmuna sjukdomar ^13.

Protocol

All användning av djur har utförts i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Beredning av Mixer och media Steril PBS pH: 7,3 (1 L) 0,23 g NaH 2 PO 4 1,15 g Na 2 HPO 4 9,0 g NaCl Tag upp volymen med avjoniserat vatten. Sterilisera med autoklav. Cell Culture Media (100 ml) 89 ml RPMI <br…

Representative Results

Denna Th17 differentiering protokoll börjar med avlägsnandet av mjälten och armhålan, brachial, mesenteriska, cervikal och inguinala lymfknutor. En representation av placeringen av varje kan hittas i figurerna 2 och 3. Figurerna 1 och 5 både ge en visuell representation av de metoder som beskrivs i detta protokoll. Denna Th17 protokoll fokuserar på differentiering av CD4 + CD25-T-lymfocyter befolkningen. Det är viktigt att notera hur …

Discussion

Här har vi beskrivit det protokoll för att uppnå in vitro Th17 differentiering. Studien av Th17 differentiering är viktig, eftersom differentieringen av T-lymfocyter in i Th17 delmängd är kritisk för en effektiv eliminering av humana patogener ^13. Omvänt har IL17 produktion förknippats med autoimmun sjukdomsprogression ^13. Förfarande enligt Th17 differentiering är tillämpbar på många forskningsinställningar som det kan tillämpas på ett stort antal distinkta murina modeller…

Materials

			Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
			Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad