Summary
En fremgangsmåde til syntese af luftfølsomme titan og vanadium anticancermidler er beskrevet sammen med evalueringen af deres cytotoksiske aktivitet over for human cancer cellelinie ved MTT-analysen.
Abstract
Titan (IV) og vanadium (V)-komplekser er meget potente anticancer-midler. En udfordring i deres syntese henviser til deres hydrolytiske ustabilitet bør derfor gennemførte deres forberedelse under en inert atmosfære. Vurdering af anticancer-aktivitet af disse komplekser kan opnås ved MTT-assayet.
MTT assayet er en kolorimetrisk levedygtighedsassay baseret på enzymatisk reduktion af MTT molekylet til formazan, når det udsættes for levedygtige celler. Resultatet af reduktion er en farveændring af MTT molekyle. Absorbansmålinger forhold til en kontrolgruppe bestemme procentdelen af tilbageværende levedygtige kræftceller efter deres behandling med varierende koncentrationer af en testet forbindelse, der er oversat til den sammensatte anticancer aktivitet og dens IC50-værdier. MTT-analysen er meget almindelig i Cytotoksicitetsstudier på grund af sin nøjagtighed, hurtighed og relative enkelhed.
Heri vi presendte en detaljeret protokol til syntese af luftfølsomt metal baserede lægemidler og cellelevedygtighed målinger, herunder forberedelse af cellepladerne inkubation af forbindelserne med cellerne, levedygtighedsmålinger hjælp af MTT-assayet, og bestemmelse af IC50-værdier.
Introduction
Kemoterapi er stadig en af de vigtigste kurser af behandlinger ansat i klinikken for forskellige kræftsygdomme, og dermed store mængde af forskning er udført på verdensplan med henblik på at udvikle nye og forbedrede anticancer narkotika. Sådanne undersøgelser oftest begynder på det kemiske niveau, med design og fremstilling af forbindelserne, efterfulgt af biologisk evaluering af de cytotoksiske egenskaber in vitro. Cellelevedygtigheden kan vurderes ved forskellige analyser, der giver oplysninger om cellulær aktivitet 1-2.
Cisplatin er et eksempel på en platin-kompleks, der er almindeligt anvendt som et kemoterapeutisk lægemiddel, der betragtes som en effektiv behandling primært til testis-og ovariecancer 3-4. Men dens smalle aktivitetsområde og alvorlige bivirkninger udløse studier af andre potente overgangsmetalkomplekser 5-8. Blandt andre, titan (IV) og vanadium (V)-komplekser viste lovende resultater af høj aktivitet og en reducerettoksicitet 9-16. Ti (IV) komplekser var de første til at indtaste kliniske forsøg efter cisplatin grund af disse egenskaber, men de har undladt forsøgene på grund af formulerings vanskeligheder og hydrolytisk ustabilitet. Der er derfor et aktuelt behov for at udvikle forbedrede derivater af disse metalkomplekser, der kan kombinere høj anticancer aktivitet med vandtæthed 15,17-21.
En udfordring i fremstillingen af Ti (IV) og V (V) komplekser refererer til den hydrolytiske ustabilitet precursor reagenser og derfor bør indifferent atmosfære fastholdes. Fremstillingen af Ti (IV) og V (V)-forbindelser udføres under N2 eller Ar forhold i en handskekasse eller ved hjælp af Schlenk line teknikker.
En almindelig metode til vurdering af anti-cancer-aktivitet er baseret på MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) analysen. Denne analyse er en kolorimetrisk levedygtighedsassay som blev præsenteret i 1983 af Mosmann22.. Det er yderst godt undersøgt og karakteriseret, og det anses for meget effektiv, når vurdere effektiviteten af nye cytotoksiske forbindelser på grund af deres nøjagtighed, hurtighed, og dens evne til at blive anvendt på forskellige cellelinier. Denne levedygtighed assay er baseret på farveændringen af MTT-molekylet, når det udsættes for levedygtige celler. Måling af absorbans, som er proportional med antallet af levedygtige celler, og sammenligning med ubehandlede kontroller, muliggør vurdering af cellevækstinhibering kapaciteter af den testede forbindelse.
MTT kolorimetrisk assay udføres i en 96-brønds pladeformat 23. Cellerne kan kræve præinkubation i brøndene, før tilsætning af det testede stof. Præinkubation tider kan variere fra 0 til 24 timer efter cellelinien egenskaber. Cellerne er normalt udsat for stoffet i 24-96 hr afhængig af narkotika aktivitet. MTT-opløsning tilsættes derefter til de behandlede celler, hvor råberow MTT reduceres til violet formazan af en række mitokondriske og cytosoliske enzymer, der er i drift i levedygtige celler (figur 1) 24. MTT molekylet ikke mindskes af døde celler eller røde blodlegemer (metabolisk inaktive celler), milt celler (hvilende celler) og concanavalin A-stimulerede lymfocytter (aktiverede celler) 22. Efter 3-4 timers inkubering med MTT formazan bundfald. Dannelsen af formazan begynder efter 0,5 timers inkubation, men for at opnå optimale resultater er det bedst at udsætte cellerne for MTT i mindst 3 timer 22. Følgelig vækstmediet fjernet, og formazan opløses i et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis isopropanol 25, skønt DMSO også kan anvendes 26. Elimineringen af mediet er afgørende for at opnå nøjagtige resultater, da phenolrødt, som er meget almindelig i vækstmedium, og udfældende proteiner kan interferere med absorbansmåling 25. Når formazan opløsningen når homogent, opløsningens absorbans måles ved anvendelse af en mikropladelæser spektrofotometer. Absorbansen ved 550 nm er direkte proportional med antallet af celler i området 200-50,000 celler per brønd, og således meget små mængder af celler kan påvises 22. Absorbansen angiver mængden af levedygtige celler, der var tilbage efter behandling med lægemidlet, og sammenlignes med absorbansen af kontrolceller, der ikke var eksponeret for lægemidlet. Analyse af resultaterne efter en ordentlig software giver IC50 (hæmning koncentration 50%) værdier og deres statistiske fejl baseret på flere gentagelser af målingen.
MTT assayet er meget almindelig i cytotoksicitetsundersøgelser til screening af nye anticancer-forbindelser, på grund af sin nøjagtighed og relative enkelhed. Men ved anvendelse af MTT-assayet, der er afhængig enzymatisk reaktion, må man overveje, at forskellige enzyminhibitorer kan påvirke reduktionen af MTT end føre til falske resultater 27. Hertil kommer, at MTT assay ikke give nogen oplysninger om den molekylære mekanisme af den cytotoksiske aktivitet af lægemidlet 2..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- Forberedelse af V (V) kompleks (figur 2), 18 adfærd trin 1,1-1,4 i en handske-box, hvis en handske-box ikke er tilgængelig, skal du springe til den alternative trin 2 (2,1-2,6).
- Opløs 0,42 mmol af ligander H 2 L i tør THF og føje den til en opløsning under omrøring af tilsvarende mængder af VO (O i Pr) 3 i THF.
- Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter og fjerne de flygtige stoffer under vakuum.
- Tilføj kold hexan og fjerne det under vakuum. En mørk violet pulver skal opnås i et kvantitativt udbytte.
- 8 mg af den opnåede forbindelse afvejes i en Eppendorf-hætteglas. Gå til trin 3.
- Forbered V (V)-kompleks ved hjælp af en Schlenk linie.
- Opløs 0,42 mmol af liganden H 2 L i tør THF i en tør Schlenk kolben med en septumhætte, tillægger en Schlenk linie og anvende vekslende vakuum / inaktiv gas (N 2 eller Ar) miljøer, anbefales det at anvende tre sn sådan runder og vente 2-5 min på vakuum etaper.
- Tilføj tørt THF via en sprøjte gennem septumhætte.
- Tilføj ækvivalente mængder af VO (O i Pr) 3 i en THF-opløsning, der var fremstillet på lignende måde ved at koble en passende tør Schlenk-kolbe til linjen anvende et inaktivt miljø og tilsætning af reagenser gennem en sprøjte fra vanadium opløsning som i liganden.
- Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter og fjerne de flygtige stoffer under vakuum, og hvis der er en bekymring for ustabile produkter udføre destillationen Schlenk type af de flygtige stoffer under inert atmosfære, bruge strøm af inert gas til at fastgøre den krævede glas, som var blevet fortørret .
- Tilføj kold hexan og fjerne det under vakuum. En mørk violet pulver skal opnås i et kvantitativt udbytte.
- 8 mg af den opnåede forbindelse afvejes i en Eppendorf-hætteglas.
- Fremstilling af Ti (IV)-kompleks (figur 2), 28
- Opløses 0,35 mmol af liganden H 2 L i tør THF og føje det til en omrørt opløsning af ækvivalente mængder af Ti (O i Pr) 4 i THF.
- Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer. Fjern de flygtige stoffer under vakuum til opnåelse af et gult produkt i et kvantitativt udbytte.
- 8 mg af den opnåede forbindelse i Eppendorf hætteglas vejes.
- Kultur HT-29-celler i en 75 cm2 kolbe med RPMI-1640-medium, der indeholder 1% penicillin / streptomycin antibiotika, 1% L-glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS), ved 37 ° C med 5% CO 2 .
- Fjern mediet, når de HT-29-celler nå maksimal konfluens (90-100%, hver 3-4 dage uden subkultur). Vask med 1 mltrypsin (0,25%) / EDTA (0,05%) opløsning og fjerne det.
- Tilsæt 1 ml trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%) opløsning og inkuberes i 5 min.
- Afmonter HT-29-celler fra kolben, og der tilsættes 10 ml af mediet for at deaktivere trypsin aktivitet. Overfør 5 ml celler blandingen til et rør.
- Brug pipetten til at overføre et par dråber af cellerne blandingen i counter kammer. Tælleren kammer indeholder 5 x 5 pladser.
- Tæl cellerne i 5 repræsentative firkanter ved hjælp af et mikroskop: de 4 firkanter i hjørnerne og en, der er i midten.
- Beregn det anslåede beløb af celler til stede. Sum cellerne i de 5 repræsentative pladser og dividere med 20..
- Divider 0,6 af resultatet af trin 4.7. Den modtagne nummer er den mængde celleblanding kræves per plade. Denne beregning refererer til en plade, der indeholder 0,6 x 10 6 celler (9.000 celler per brønd).
- Brug pipette til at overføre den mængde celleblandingen kræves per psent (som beregnet i afsnit 4.8), og der tilsættes 13,2 ml af mediet (200 ul pr godt × 66 brønde).
- Tilsæt blandingen til 96-brønds plade med 11-kanals pipette (200 pi per brønd, 6 linier, 66 brønde i alt). Et godt på hver linje skal forblive tomt for blindprøvekontrollen.
- Inkubér pladen ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer for at tillade cellerne at fastgøre til pladen.
- Tilsæt 200 pi (eller andet beløb svarende til den ønskede koncentrationsområde) tørt THF til 8 mg af hver forbindelse vejes som beskrevet i trin 1.4 (eller 2.6), eller 3,3. 8 mg af liganden H 2 L afvejes, også.
- Hver forbindelse fortyndes yderligere ved tilsætning af 60 pi af THF i 9 forskellige Eppendorf hætteglas.
- Overfør med en pipette 60 pi fra blandingen i afsnit 5.1 til første Eppendorf hætteglas, resuspender og overførsel 60 pi til næste hætteglas, og så videre indtil 10 forskellige koncentrationer er obtained (herunder forælder blandingen i afsnit 5.1).
- Fortynd 20 pi af hver koncentration i THF med 180 pi medium.
- Forbered en kontrol løsning med kun THF; 20 ul THF med 180 pi medium i hver måling.
- Der tilsættes 10 pi fra den resulterende opløsning (herunder THF kontrol), til hver brønd, der allerede indeholder 200 pi af den førnævnte opløsning af celler i mediet for at give endelige koncentrationer af forbindelsen på op til 200 mg / L (koncentrationsintervallet kan ændres i henhold til forbindelsen aktivitet).
- Du kan observere nogle udfældning ved den højeste koncentration anvendes afhængigt af de sammensatte opløselighed.
- Gentag hver måling af sammensatte 3x (3 linjer i pladen af samme forbindelse), hver linje indeholder: celler behandlet med stoffet i 10 forskellige koncentrationer, 1 celler godt indeholdende behandlet med opløsningsmiddel kun til kontrol og 1 godt uden celler til blank kontrol.
- Inkubér loaded plade i 3 dage ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære.
- Forbered MTT-opløsning ved tilsætning af 1 g MTT pulver til en 200 ml opløsning af RPMI-1640 medium uden phenolrødt. Stamopløsningen kan opdeles til 15 ml rør og opbevaret i -20 ° C.
- Tilsæt 20 ul MTT-opløsning til hver brønd ved hjælp af 11-kanals pipette (undtagen til blindprøvekontrollen brønde uden celler fra trin 4.10), og der inkuberes pladen for yderligere 3 timer.
- Fjern mediet opløsning fra hver brønd.
- Tilsæt 200 pi isopropanol til hver brønd for at opløse formazan. Rør pladen i 0,5 time, indtil ensartethed er nået.
- Absorbansen ved 550 nm i 200 pi af den førnævnte opløsning af en mikropladelæser spektrofotometer.
- Gentag hver måling (som omfatter 3 gentagelser, se trin 5.8) på 3 forskellige dage.
- Beregn than procentdel af cellernes levedygtighed ved at trække blindprøvekontrollen absorbans værdi fra den målte værdi, dividere resultatet med absorbansen af THF værdi kontrol opløsningsmiddel og multiplicere med 100%.
- Beregn IC50-værdier ved hjælp af GraphPad Prism software (eller tilsvarende).
- Den rapporterede IC50 er gennemsnittet af alle IC50-værdier indsamlet på mindst tre forskellige dage, og fejlværdien er standardafvigelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De komplekser blev udarbejdet på grundlag af etablerede procedurer 18,28 og renhed kan vurderes ved NMR og elementært analyse.
De modtagne fra MTT assay data analyseres for at vurdere cytotoksicitet for forbindelsen 18,21. Først er fratrækning af blindprøvekontrollen absorbans værdi fra alle de andre værdier udføres. Sekund, THF værdi kontrol opløsningsmiddel sat til 100% levedygtighed som ingen vækstinhiberende forbindelse blev tilsat. Alle andre værdier omdannes til procent levedygtighed efter kontrollen. Koncentrationerne anvendt, og den relative spireprocenten beregnes derefter indsat i GraphPad Prism software (eller tilsvarende) for at bestemme IC50-værdier baseret på en ikke-lineær regression af en variabel hældning (fire parametre) model (figur 4, tabel 1) 29.
Målingerne skal udføres på en rækkeaf fusioner, der vil producere en graf viser en even fordeling: mindst tre punkter på hver plateau og tre point for at definere hældning (figur 3, graf A). Utilstrækkelige målinger ved høje koncentrationer eller lave koncentrationer (Figur 3, graf B) vil forringe lineær regression fit af kurven kræves til bestemmelse af IC50-værdier, og som et resultat, mindske deres nøjagtighed.
Relative IC50-værdier, som bestemt ved lineær regression fit 29, svarer til de koncentrationer, der fører til 50% af inhiberingen muligt cellevækst af den testede forbindelse, der beregnes som midtpunktet mellem maksimal og minimal cellelevedygtighed målt (ikke nødvendigvis 100% og 0%, se figur 3, graf C, a). For eksempel, hvis en forbindelse inhiberer kun 60% af cellevækst i forhold til kontrollen (og 0% ved lav koncentrations), dens relative IC50 er den koncentration, der fører til 30% inhibering i forhold til kontrollen. Fejlværdierne bør afspejle afvigelse af de opnåede resultater for forskellige gentagelser fra den gennemsnitlige IC50-værdien rapporteret, taget som kønssygdomme. Desuden bør maksimal cellevækstinhibering (%) værdier indberettes, som beregnes ved at trække 100% den minimale levedygtighed måles.
En alternativ metode kan omfatte bestemmelse af absolutte IC 50 værdier. Disse svarer til de koncentrationer, der fører til 50% hæmning af cellevæksten i forhold til 100% kontrol af, uanset maksimal og minimal cellelevedygtighed målt. Disse værdier kan også være afledt af en ikke-lineær regressionsmodel. Da disse værdier er absolut, er valgfri rapporterer den maksimale cellevækstinhibering værdier. Som vist i figur 3, kurve C, en forbindelse kan have en relativ lav aktivitet i form af maksimal celle gæ kst hæmning egenskaber (kurve a), og stadig udviser en relativ IC50-værdi, der er lavere end ikke kun dens absolutte én, men også end en forbindelse, der når tæt på 100% vækstinhibering (kurve b). Det er således yderst værdifuldt at præsentere kurve sammen med de rapporterede IC50-værdier af nogen art.
Ved inspektion af resultaterne af de forsøg, der er beskrevet i protokollen (Figur 4, tabel 1), er det klart, at cisplatin og komplekser LTI (O i Pr) 2 og VO (O i Pr) er meget aktive. Det er også bemærkelsesværdigt, at den nærmere den maksimale hæmning af en given forbindelse er på 100%, jo tættere relative IC50-værdien er den absolutte én. Ved sammenligning af IC50-værdier blandt de forskellige forbindelser, Ti (IV)-kompleks har den højeste cytotoksicitet og dens IC50-værdier er lavere end cisplatin og V (V)-kompleks. Men free ligand udviser markant reduceret aktivitet, da efter tilsætning af liganden ved forskellige koncentrationer, betyder cellelevedygtigheden ikke falde så meget som det gør for sine komplekser. Dette sikrer, at det høje aktivitetsniveau af komplekserne anticancer afhængig af metal. Da den frie ligand næppe når op på 50% cellevækstinhibering, en absolut IC50-værdi kan ikke præcist udledes. Faktisk er en relativ værdi kunne heller ikke er blevet tilstrækkeligt beregnet af software på grund af den mindre aktivitet og tilsvarende høj fejlværdier. Ikke desto mindre er det klart, at selv hvis en relativ IC50-værdi kunne have været udledt for H 2 L, ville det ikke have afspejlet en mærkbar aktivitet, hvilket gør rapporten fra den maksimale hæmning af værdien langs med relative IC 50 værdier (og skildringen af kurven) afgørende.
| Relativ IC50 (uM) | Absolut IC50 (uM) | Maksimal inhibering (%) | |
| LVO (O i Pr) | 13 ± 3 | 19 ± 8 | 81% |
| LTI (O i Pr) 2 | 3 ± 1 | 5 ± 3 | 87% |
| H 2 L | - | - | 47% |
| Cisplatin | 14 ± 5 | 13 ± 6 | 91% |
Tabel 1. Cytotoksicitetsstudier resultater for de testede forbindelser: Relativ og absolut IC 50 (uM) og maksimale cellevækstinhibering værdier mod HT-29 celler efter en inkubationstid på tre dage med V (V) kompleks LVO (O i Pr), Ti (IV ) komplekset LTI (O i Pr) 2, fri ligand H 2 L og cisplatin 18,21 IC50-værdier er givet som gennemsnit på l east tre gange tre gentagelser med fejlværdier som de kønssygdomme.
Figur 1.. Reduktionen af MTT af mitokondrie og cytosole enzymer til formazan. Klik her for at se større figur .
Figur 2.. Udarbejdelse af V (V) og Ti (IV) komplekser 18,28. Klik her for at se større figur .
Figur 3.. Eksempler på resultater af cellelevedygtighedsassays målinger. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Dosisafhængig cytotoksicitet kurver for de testede forbindelser: Afhængighed af HT-29 cellelevedygtighed på administreret koncentration af V (V)-kompleks LVO (O i Pr) (blå), Ti (IV)-kompleks LTI (O i Pr) 2 ( rød), fri ligand H 2 L (sort) og cisplatin (grøn), efter en inkubationstid på tre dage, som obtained fra mindst tre gange tre gentagelser som afspejlet i fejlværdier 18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet i dette manuskript metode kombinerer kemisk syntese med biologisk cellelevedygtighed assay. Som med enhver biologiske metoder vedrørende levedygtige celler, er det vigtigt at arbejde i en laminar hætte og vedligeholde sterile forhold, herunder anvendelse af sterile organiske opløsningsmidler. Desuden bør tilberedning og opbevaring af hydrolytisk ustabile metal baserede lægemidler udføres under inerte betingelser, som handskerum eller Schlenk line teknikker bør udnyttes.
Valget af teknik til at arbejde under inert miljø er for det meste afhængig af tilgængeligheden af en handskekasse. Hvis man er til rådighed, alle synteser, der kræver stuetemperaturbetingelser er yderst bekvemt at udføre deri. Synteser, der kræver opvarmning normalt tages ud af kassen i en Schlenk-kolbe, og er fastgjort til Schlenk linie. Når en handske-box ikke er tilgængelig, kan alle manipulationer udføres med nøje udvalgte glasvarer på et Schlenk linje, mens du bruger vakuum / inaktiv gas (N2 eller Ar) manipulationer for at opretholde tør atmosfære.
I cytotoksicitet evalueringsprocessen, er det nødvendigt at undersøge forekomsten af celler i hele forsøget. Før starten af forsøget, bør vækstmediet raske adhærente celler være klar. Et kontamineret kultur vises uklar. Også efter inkubation af cellerne med trypsin-EDTA, bør cellerne løsnes fra kolben og nedsænkes i mediet. Hvis de fleste af cellerne forblive klæbet til kolben, bør kolben inkuberes yderligere i flere minutter.
Længden af en sådan måling er fem dage. Vi tillader én dag for de adhærerende celler at vedhæfte og akklimatisere til cellen plade, og tre dage til inkubering af cellerne med de testede lægemidler med henblik på at gøre det muligt for cellerne at gå videre til apoptose. En ekstra dag er nødvendig for inkubation med MTT. Hele overvånt bør gentages mindst to gange mere på forskellige dage startende fra forskellige cellekulturer, for målingerne at være uafhængige.
Den teknik, som beskrevet heri anvendes på vedhængende celletyper. For at anvende denne metode på adhærerende celletyper bør foretages flere justeringer. Det er ikke længere nødvendigt at afsætte en dag til at cellerne kan vedhæfte og akklimatisere sig til den celle plade, og derfor forberedelsen af pladen og supplement af de testede stoffer kan ske på samme dag. Desuden, i det sidste trin af målingen umiddelbart efter inkubation af cellerne med MTT opløsningen skal centrifugeres, før fjernelse af mediet og tilsætning af isopropanol.
Det er også muligt at erstatte udnyttelsen af MTT som markør af vitale celler med et alternativt assay til cellevækstinhibering, hvor inkubationstiden af cellerne med markøren er kortere end That med MTT 30. En anden faktor til at overveje, når du vælger markøren er mulig virkningsmekanisme for narkotika testede 27. MTT-assayet giver oplysninger om mitokondrier metabolisk aktivitet, og da den er afhængig af enzymatiske reaktioner, kan det blive påvirket af enzymhæmmere.
Kombinationen af lægemiddel præparat med evaluering af cytotoksicitet ved MTT-assayet er en effektiv metode til udvikling af nye metal-baserede cytotoksiske lægemidler. Ikke desto mindre virker denne metode ikke giver nogen oplysninger om celledød mekanisme fasen i cellecyklus, der er påvirket af narkotika og dens mulige biologiske mål. Til disse formål yderligere metoder, såsom Propidiumiodid (PI) Optagelse Assay og Cell Cycle Analysis skal udføres 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering blev modtaget fra Det Europæiske Forskningsråd under Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) / ERC tilskudsaftale nr. [239.603]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
References
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E.
- Evangelou, A. M.
- Djordjevic, C.
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C.
- Caruso, F., Rossi, M.
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A.
- Buettner, K. M., Valentine, A. M.
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
