Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores
Summary
Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.
Abstract
Métodos para a rápida imobilização superfície de pequenas moléculas bioativas com controle sobre orientação e densidade de imobilização são altamente desejáveis para aplicações de biossensores e microarray. Neste estudo, nós usamos um covalente bioorthogonal altamente eficiente [4 +2] reação de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir a imobilização microfluídicos de moléculas TCO / Tz-derivados . Nós monitoramos o processo em tempo real, em condições de fluxo contínuo, utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Para permitir a imobilização reversível e estender o intervalo experimental de a superfície do sensor, que combinam um componente de captura de antígeno-anticorpo não-covalente com a reacção de cicloadição. Ao apresentar alternadamente TCO ou Tz metades à superfície do sensor, vários processos de captura de cicloadição são agora possíveis em uma superfície do sensor para montagem on-chip e interação estudos de uma variedade de estruturas multi-componentes. Nós illustrate este método com duas experiências diferentes de imobilização sobre um chip de biossensor; uma molécula pequena, AP1497, que liga a proteína de ligação de FK506 12 (FKBP12), e a mesma molécula pequena, como parte de uma nanopartícula funcionalizado situ imobilizada e em.
Introduction
Reações de conjugação eficientes são ferramentas valiosas para a fixação de moléculas bioativas em superfícies para uma variedade de aplicações biotecnológicas. Recentemente, o bioorthogonal muito rápido [4 +2] de reacção de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) tem sido utilizado para marcar as superfícies das células, estruturas subcelulares, anticorpos e nanopartículas 1. – 7 Aqui, usamos o [4 +2] reação de cicloadição em combinação com captura de antígeno / anticorpo (GST / anti-GST) para síntese reversível on-chip de estruturas multi-componentes para a superfície Plasmon Resonance (SPR) análise da interação e monitorar o processo em tempo real (Figura 1). 8,9 Notavelmente, a estratégia de captura de cicloadição permite a regeneração da superfície utilizando um protocolo estabelecido. 8 Consequentemente, a montagem de superfícies de sensores estáveis com controlo sobre a orientação e densidade de ligando para a variedade de ensaio novo formatos é agora possível. Utilizaçãoesta estratégia que demonstram a imobilização de moléculas pequenas TCO / Tz derivatizados e caracterizar as taxas de cicloadição de uma variedade de condições de tampão. Escolhemos a interacção conhecida entre FKBP12 e AP1497 uma molécula que se liga a FKBP12 10-12 por exemplo, para verificar se a estratégia de captura de cicloadição preserva a capacidade da molécula pequena de interagir com o seu alvo, quer directamente, quando ligado a antigénios GST imobilizadas ou nanopartículas imobilizadas (NPS).
Este método proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, a imobilização reversível de pequenas moléculas em chips sensores agora é possível. Em segundo lugar, TCO / Tz imobilização de pequenas moléculas também permite estudos de interacção livre de rótulo que revertem a orientação de estudos SPR canônicas, e pode fornecer uma visão complementar de uma interação de ligação. Em terceiro lugar, este método permite a síntese de microfluidos de nanopartículas alvo, e a avaliação imediata da sua bindinpropriedades g. Este promete melhorar a eficiência da avaliação ou triagem nanopartículas alvo, e também diminuir as quantidades requeridas de nanopartículas. 13-15 Em quarto lugar, esta abordagem pode medir a cinética de reacção de reacções de cicloadição bioorthogonal em tempo real, sob fluxo contínuo. Finalmente, a imobilização química do TCO / Tz é robusta na presença de soro. Tomados em conjunto, prevemos que esta abordagem versátil amplamente facilitar a construção de superfícies estáveis sensores para uma grande variedade de estudos microfluídicos com relevância para a in vitro e em aplicações celulares in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de captura-cicloadição descrita aqui permite a rápida imobilização, reversível de nanopartículas modificadas e pequenas moléculas para a interação baseada em chip sem rótulo e estudos cinéticos. O protocolo de imobilização pode ser realizada em minutos, que requerem <10 uM concentrações de ligandos de pequenas moléculas. Modulando concentração de ligante e densidades de imobilização tempo de contato pode ser rigorosamente controlado. Nossos dados mostram que no chip reações bioorthogo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos financiamento do NIH (NHLBI Contrato n º HHSN268201000044C a RW, SH e SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
