MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

摘要

本文描述了一种 原位 适用于福尔马林固定肾组织切片中microRNA表达比色检测的杂交实验方案优化

摘要

本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 探针进行原位杂交，从而在肾脏组织中实现 miRNA 比色检测的方法。in situ 杂交最初由 Kloosterman 及其同事建立，广泛适用于 Exiqon miRNA 探针¹，本文对该方法进行了改进，以克服在肾脏组织中进行 miRNA 分析时固有的技术难题，包括组织结构识别困难以及探针和抗体残留难以彻底去除等问题。采用相对较薄（5 mm 厚）的组织切片，可在保留细胞内强探针信号的同时，实现肾脏结构的清晰可视化。此外，优化了探针浓度和孵育条件，以在背景信号和非特异性信号较低的情况下，有效显示 microRNA 的表达水平。本文详细描述了该优化后的实验流程，涵盖从组织采集与制备到最终载玻片封片的全部步骤。本方案的基本组分可根据需要调整，适用于其他组织及细胞培养模型的研究。

引言

microRNA 是一类小的非编码 RNA（约 22 个核苷酸长），在细胞内源性产生。它们通常通过翻译抑制或 mRNA 降解来抑制蛋白质表达。miRNA 与 mRNA 靶标结合时互补性不完全，因此单个 miRNA 可能抑制多个靶标。

了解哪些细胞类型和结构表达miRNA，是理解miRNA表达改变如何影响细胞和组织表型机制的重要部分。虽然miRNA测序、qPCR和Northern blotting等方法可用于检测整体组织中的miRNA，但这些方法无法确定miRNA具体来源于组织内的哪一类特定细胞。在使用这些方法前对细胞和结构组分进行分离非常困难，且实现有效分离所需的条件可能导致基因表达改变或RNA降解。microRNA原位杂交是一种用于可视化miRNA在组织中定位及其表达水平的技术。该技术在由异质性结构组成的组织（如肾脏）中尤为有价值。

MicroRNAs 已被证实对肾脏发育具有调控作用^2,3 生理学⁴微小RNA表达改变也已被证实参与肾脏病理过程，例如纤维化^5-10糖尿病肾病⁷，肾细胞癌^11,12，以及急性肾损伤¹³在我们的研究中，我们发现优化微小RNA 原位 肾组织的原位杂交对于确定miRNA在健康和疾病状态下的确切结构定位具有重要价值¹⁴

方案

1. 肾脏组织切片

1. 使用 Microm HM 355 S 将经10%甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片切成5 mm厚的切片，并置于显微镜载玻片上。这些载玻片可在分析前储存数月。

2. 溶液配制

1. 在可高压灭菌的螺旋盖瓶中，用 1 L 去离子水（ddH₂O）配制 1× PBS 溶液。另取一个瓶子加入 1 L 去离子水（ddH₂O）。向每个瓶中加入 1 ml DEPC，盖紧后剧烈摇晃。室温下静置过夜，以灭活 RNase，随后进行高压灭菌。向 1 L 1× PBS 中加入 400 ml Tween-20，配制成 PBS-T 缓冲液。
2. 配制蛋白酶 K 缓冲液（含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 1 mM CaCl₂，溶于经 DEPC 处理的水中）。
3. 用 PBS-T 配制 0.2% 甘氨酸溶液。

3. 组织制备

1. 制备大量杂交缓冲液（50–100 ml），其中包含50%甲酰胺、5× SSC、0.1% Tween、9.2 mM柠檬酸（用于调节pH至6）、50 µg/ml肝素和500 µg/ml酵母RNA，溶于DEPC处理的ddH₂O中。分装为1 ml等份，于-80 ºC保存。
2. 用....

结果

在杂交、孵育或洗涤步骤中，组织切片中发生干燥的区域通常会在NBT/BCIP显色过程中出现更深的染色。图1显示了一张肾组织切片的部分区域，其中HybriSlip从组织边缘滑脱，导致该区域部分脱水。尽管在后续步骤中进行了再水化和覆盖，脱水区域的信号仍人为增强。

控制NBT-BCIP显色时间的重要性如图2A和图2B所示。显色时间超过4-5小时会导致在肾组织中，scrambled-miR对照探针出现明显的非特异性着色（图2A）。对于高丰度靶标（如U6小核RNA对照）的探针检测，孵育时间超过4-5小时并不能改善信号强度（图2B）。

在图3中展示了本研究所述原位杂交（ISH）方法在肾组织中检测miRNA的适用性，该图改编自Kriegel 等¹⁸的研究。在该研究中，我们发现与假手术动物相比，单侧输尿管.......

讨论

本文的目的是描述一种在福尔马林固定的肾脏组织中效果良好的miRNA原位杂交（in situ hybridization）实验方案。在优化该方案的过程中，已识别出多个导致染色伪影的重要来源。仔细注意这些关键点有助于避免染色伪影，并提高原位杂交实验成功的可能性。

在长时间孵育过程中，组织切片干燥是导致染色假象最可避免的原因之一。一旦发生干燥，干燥区域在NBT/BCIP显色过程中会呈现非常深的染色（图1）。在整个实验流程中，必须确保所有孵育步骤期间组织切片始终完全被液体覆盖，并且载玻片始终保持完全水平。此外，在杂交步骤和抗体孵育等长时间孵育过程中，应使用HybriSlip覆盖组织切片，以帮助防止液体蒸发。若观察到组织切片出现部分或完全干燥，则样品很难获得理想的染色结果，从而无法对这些样品中的miRNA表达进行准确解读。

在蛋白酶K消化和多聚甲醛处理步骤中，液体覆盖同样至关重要。该消化步骤的目的是允许miRNA探针进入细胞。如果在短暂孵育期间组织未能完全被液体覆盖，则未暴露于酶消化的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Sigma	P6148
磷酸盐缓冲液	Gibco	70011044
焦碳酸二乙酯	Sigma	D5758
吐温-20	Sigma	P1379
二甲苯	Sigma	534056
乙醇	Ultra Pure	200CSPTP
Tris-HCl	Life Technologies	15506-017
CaCl2	Sigma	C2536
甘氨酸	J.T. Baker	4059-00
柠檬酸	Sigma	C2404
甲酰胺	Sigma	F9037
20x SSC 缓冲液	Life Technologies	15557-044
肝素	SAGENT	25021-400-30
酵母 RNA	Life Technologies	AM7118
MgCl2	Sigma	M8266-1004
NaCl	J.T. Baker	4058-01
蛋白酶 K	Fermentas	EO0491
3’ DIG- miRNA 探针	Exiqon	miR dependent-05
3’ DIG- 随机 miR 探针	Exiqon	99004-05
3’ DIG- U6 miR 探针	Exiqon	99002-05
抗地高辛抗体 Fab 片段	Roche	11093274910
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Permount 封片剂	Fisher	SP15-500
盖玻片	Fisher	根据组织大小适配
Microtom HM 355 S 切片机	Thermo Scientific	23-900-672
载片式杂交孵育箱	Boekel	241000
铝制托盘组件	Boekel	C2403973
不锈钢架插入件	Boekel	C2403754