Coltura e manutenzione<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In un ambiente anaerobico

Sommario

Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.

Abstract

Clostridium difficile è un anaerobico, batteri sporigeni Gram-positivo che è principalmente responsabile della diarrea associata agli antibiotici (AAD) ed è un importante patogeno nosocomiale. C. difficile è notoriamente difficili da isolare e coltivare ed è estremamente sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell'ambiente. Qui, metodi per isolare C. difficile da campioni fecali e successivamente coltura C. difficile per la preparazione degli stock di glicerolo per la conservazione a lungo termine sono presentati. Sono anche descritte tecniche di preparazione e l'enumerazione scorte spore in laboratorio per una varietà di applicazioni a valle compresi studi di microscopia e animali. Queste tecniche richiedono una camera anaerobica, che mantiene un ambiente anaerobico coerente per garantire condizioni appropriate per ottimale C. la crescita difficile. Forniamo protocolli per il trasferimento di materiali e dalla camera senza cautilizzando una contaminazione significativa ossigeno insieme con suggerimenti per la manutenzione periodica necessaria per sostenere l'ambiente anaerobico adeguato per un efficiente e coerente C. la coltivazione difficile.

Introduzione

Clostridium difficile è un batterio Gram-positivi, sporigeni batterio che è un anaerobio obbligato e un agente patogeno gastrointestinale potenzialmente fatale di uomini e animali. Inizialmente descritto nel 1935 come un organismo commensale trovato in campioni di feci da neonati ^1, C. difficile è stato poi dimostrato di essere l'agente eziologico della colite pseudomembranosa associata a trattamento antibiotico ^2. C. infezioni difficile (CDI) sono in genere preceduti da un trattamento antibiotico che provoca l'interruzione della normale flora del colon, creando una nicchia per C. difficile a ....

Protocollo

Nota: C. difficile è un patogeno umano e animale che può causare malattie gastrointestinali. Esperimenti C. difficile deve essere eseguita con le opportune precauzioni di biosicurezza (BSL-2).

1. Anaerobica Camera Uso e Manutenzione

C. difficile è un rigoroso anaerobio ed è estremamente sensibile anche basse concentrazioni di ossigeno nell'atmosfera. Pertanto, è necessario un ambiente anaerobico controllato per la sua manipolazione successo. L'uso di una camera anaerobica (Figura 1A) fornisce l'ambiente più stabile e le condizioni ideali per la coltivazione....

Risultati

Un esempio di C. difficile coltivate su bhis e Columbia anaerobica pecore agar sangue media può essere visto in Figura 2. C. difficile forma colonie irregolari che sono piatta e in possesso di un aspetto a vetro smerigliato che è evidente in entrambi i supporti. Qui, un isolato clinico eritromicina sensibile di C. difficile, 630E ^30, è cresciuto su bhis agar, un arricchito, terreno non selettivo, per 24 ore a 37 ° C (Figura 2A). Colonie su Columbia .......

Discussione

I metodi qui descritti consentono il recupero semplice e veloce di C. difficile da una varietà di campioni fecali, compresi gli esseri umani, topi e criceti, nonché la conservazione a lungo termine di C. difficile come scorte glicerolo o spore. C. difficile può essere un organismo difficile da coltivare, ma accurata manutenzione di un ambiente anaerobico e l'applicazione di tecniche asettiche può provvedere robusta crescita e una riduzione della contaminazione.

Le.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Proteoso Peptone n. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anidro)	Fisher	M65
á'...-Fruttosio	Fisher	L96
Sodio taurocolato	Sigma	T4009
á'...-cicloserina	Sigma	C6880
Cefoxitina	Fluka	C4786
Cervello cuore infusione medium	BD	237300
Proteoso Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cisteina	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
agar sangue di pecora colombiana	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Anelli di inoculazione sterili	Fisher	22363596
Tamponi sterili	Fisher	1495990
Coy Camera anaerobica in vinile Coy e accessori	Coy Laboratory Products, Inc	Specificato dal cliente	Questi articoli sono ordinati su misura in base alle esigenze
Materials
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anidro) 0,1 g Fruttosio 6 g Agar 20 g Portare a 1 L con acqua deionizzata e autoclavare a 121 °C; C per 20 minuti per sterilizzare. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere: 10 ml di taurocolato di sodio al 10% (p/v), sterilizzato con filtro (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 0,1%) 25 ml di 10 mg/ml di á'...-cicloserina, sterilizzato con filtro (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 250 μ g/ml) 1,6 ml di 10 mg/ml di cefoxitina, sterilizzata con filtro (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 16 μ g/ml) BHIS Medium Infuso di cuore cerebrale 37 g Estratto di lievito 5 g Per i piatti, aggiungere 15 g di agar. Portare a 1 L con acqua deionizzata e autoclavare a 121 gradi C per 20 minuti per sterilizzare. Opzionale (aggiungere dopo la sterilizzazione in autoclave): 3 ml di L-cisteina al 10% (p/v) (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 0,03%) 10 ml di taurocolato di sodio al 10% (p/v) (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 0,1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Proteasi peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Portare a 1 L con acqua deionizzata e autoclavare a 121 gradi; C per 20 minuti per sterilizzare. Opzionale (aggiungere dopo la sterilizzazione in autoclave): 3 ml di L-cisteina al 10% (p/v) (sciogliere in acqua; concentrazione finale, 0,03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Proteasi peptone 3,5 g Infuso di cuore cerebrale 11,1 g Estratto di lievito 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Per i piatti, aggiungere 15 g di agar. Portare a 1 L con acqua deionizzata e autoclavare a 121 gradi C per 20 min per sterilizzare. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 3 ml di L-cisteina al 10% (p/v) (concentrazione finale, 0,03%). Blood agar Si consiglia l'uso di piastre di agar di sangue di pecora anaerobiche Columbia prefabbricate (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Portare a 1 L con acqua deionizzata e regolare il pH a 7,4 con HCl. Filtro Sterilizzare prima dell'uso.

del laboratorio