We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.
Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.
Floem och bark vävnader hos barrträd är värd för tusentals organismer. Phloeophagy, utfodring på floem vävnader i inre barken, är en vana som vanligtvis förknippas med barkborrar, woodborers och flera andra ryggradslösa djur och mikrobiell taxa som lever i träd 23 barkborrar. (Coleoptera: Curculionidae) utveckla och leva inom floem utom för korta perioder när vuxna söker nya värdträd. 31 barkborrar har studerats på grund av deras ekonomiska effekter på träd 18,19, men direkta beteende observationer av insekter inom träd material har varit begränsade. 4 Dessutom gallerierna konstruerats av barkborrar blivit livsmiljö för en myriad av arter. 11 Ett stort antal svampar 30, bakterier 3, kvalster 10,21 och nematoder 16,19 tillsammans med andra rovdjur och parasiter leddjur 22,24 bebor floem materialet. De tekniker som ges härmöjliggör direkt observation av barkborrar, kvalster och trä provtagare som normalt lever i subkortikala miljöer. Smärre förändringar av protokoll kan göras för att studera svampar och bakterier.
Barkborrar och associerade organismer inom träd vävnader har studerats med hjälp av en "floem smörgås." Tidig användning av denna teknik kan hittas i litteraturen som går tillbaka till 1933, då det användes för att observera larv instars av Douglas-gran beetle (Dendroctonus pseudotsugae). 2 floem sandwich har genomgått många härledningar som olika material blev tillgängliga. Ursprungligen bestod denna anordning av ett stycke av floem placeras mellan två plattor av glas, som pressats samman av elastiska band. 2 Senare har klämmor, tejp, lim, plast och andra material som har använts i konstruktionen av en smörgås. 13,14 , 15,17,26,28 Protokollet som beskrivs här erbjuder förbättringar jämfört några av de senaste design. Till exempel, iTidigare var testspecies in i sidan av den sandwich, mellan plattor av glas eller plast. Detta begränsas konstruktionen av gallerier till en riktning. Användningen av inträdes hål i topplattan ger större frihet för testarter att initiera naturliga galleri konstruktion. En annan fördel med den presenterade protokollet är dess förenklade konstruktion, som lätt kan konstrueras med några verktyg. Användningen av floem sandwich har möjliggjort direkta observationer av ätbeteende, reproduktion, utveckling och interaktioner mellan organismer som annars inte hade varit möjligt. 1,5, 22 Denna metod är också ett utmärkt verktyg för K-12 utbildning och vetenskap program och displayer.
Det finns flera nyanser i skapandet av en floem sandwich som är svåra att tolka från eller inte i handskrifter. Vi tror att det behövs en visuell (dvs, video) beskrivning av tillverkningen av en floem smörgås och skulle varaav värde för forskare och lärare som är intresserade av att studera phloeophagous organismer. Vår protokoll ger ett enkelt och billigt sätt att observera leddjur, mikrober och andra organismer som lever floem vävnad.
Den floem sandwich tillåter införande och observation av leddjur, mikrober och andra små organismer som lever floem vävnad. 1,7,8,9,17,18 Denna teknik har resulterat i nya upptäckter och en bättre förståelse av beteenden, livs historiekaraktärer, utveckling och interaktioner av organismer inom träd floem. 1,5,10 Sandwich protokoll som beskrivs här är en hybrid av tidigare mönster, och kommer att ge en ekonomisk sandwich som lätt är konstruerad med minimal utrustning och material. De glas, akryl eller polykarbonat bitar kan återanvändas, och de enda förbrukningsmaterial är Parafilm och floem.
Även om alla steg i protokollet är viktiga, bör vissa steg följas noga för att säkerställa högsta graden av framgång. För det första bör ett träd vara belägen som har ett parti av bole gratis, eller relativt fria, av grenar. Träd som har många grenar är svåra att raka och kommer yield få genomförbara floem stycken, eftersom varje gren måste skära runt när du tar bort floem. Därefter är det viktigt att minimera luft exponering av floem. Vi lägger snabbt varje floem lappar i en påse vid avlägsnande. När 3-6 stycken är borttagna, de överförs till en vakuumförseglad påse; vi använder en effektomvandlare för förseglaren av ett fordonsbatteri i fält. Senast, desinficerande akryl bitar och allmän renlighet när man utför detta protokoll kommer att minska svamptillväxt i sandwich. Detta är särskilt viktigt för förlängda observationer.
Såsom nämnts ovan finns det begränsningar i floem sandwichanordningen. Eftersom den floem skiktet är tunt, kan endast små organismer som typiskt kvar i floem införas i smörgås. Större insekter som trä borrar (dvs Buprestid, Cerambycid species) kan införas och observerades under de tidiga stadierna av livscykeln. Denna tidsram är vanligtvis begränsad till två tilltre veckor; efter denna punkt larverna kräver xylem trä att borra in för förpuppning. Däremot för barkborrar, särskilt de i släktet Ips, kan observeras, inklusive en fullständig livscykel parning, ägg kläckning, utfodring, pupating och eclosion till en vuxen skalbagge. Vid denna punkt, är livskraft smörgås vanligtvis utmattade på grund av uttorkning och svamptillväxt. 28 Dessutom går denna apparat inte att insekter att fritt och naturligt kolonisera eller lämna floem smörgås. 27
Vår protokoll är flexibel när det gäller storlek, form och typ av floem används. Korta studier kräver mindre floem material och smörgås storlek kan anpassas i enlighet därmed. Många barrträ har använts som floem givare i en floem sandwich (t.ex., ponderosa pine 12, Douglas-gran 2, gran 29, loblolly tall 27, longleaf furu 27). Material i smörgåsen kan också ändras; för exriklig, glasplattor kan användas i stället för akryl och epoxi eller tejp istället för Parafilm.
Den svåraste delen av detta protokoll är floem borttagningen. Träd bredvid varandra kan skilja sig i hur svårt deras floem är att ta bort. När ett träd har svårt floem, är tålamod kritisk. I dessa fall försiktigt köra en kniv mellan den hårda xylem och det spongiösa floem. Denna process känns bokstavligen som flås trädet.
Efter att ha bemästrat den grundläggande sandwichteknik, kan ändringar i protokollet hjälpa passar specifika behov. Till exempel genom hening de tekniker som krävs för att avlägsna floem, större bitar kan tas bort och användas för att skapa större smörgåsar. Dessutom kan förändringar göras för att tillgodose särskilda instrument, t.ex. ytterligare hål för att övervaka kemiska emissioner (Fig. 3A), eller spela in eller spela upp ljud (Fig. 3B). Ändringar kan göras för att möjliggöra halvpermanent bevarandet av floem och dess organnismer, eller för tillfälliga observationer av organismer som senare kan släppa fri.
The authors have nothing to disclose.
We thank Eli Jensen, Stefano Padilla, and Kasey Yturralde for assistance, and Karen London and anonymous reviewers of the manuscript. We thank Jake Baker and Karla Torres for video footage. Funding was provided to R.W.H by the NAU School of Forestry and NAU Technology and Research Initiative Fund (TRIF).
Draw blade | Big Horn Brand | 20265 | 11” blade |
Fillet Knife | American Angler | 30530 | 9” blade |
Polycarbonate | Nexan | GE-33 | 0.093 in. thickness |
Parafilm M | Fisher Scientific | S37441 | 2” wide |
Clamps | Pony Jaw Opening | 3201-HT-K | 4” x 1” |
Vacuum Sealer | FoodSaver | V2840, | VacLoc vacuum |
and bags | FSFSBF0742-015 | bags in rolls |