Summary
En protokol til at isolere, er kultur og image ø-celle klynger (ICCS) afledt af humane føtale bugspytkirtelceller beskrevet. Metoden beskriver de er nødvendige for at generere ICC fra væv, kultur som monolag eller i suspension som aggregater, og image for markører af spredning og pancreas celle skæbne beslutninger trin.
Abstract
For næsten 30 år har forskere vist, at humane føtale ICC'er transplanteret under nyrekapslen af nøgne mus modnet til fungerende endokrine celler, som det fremgår af en betydelig stigning i cirkulerende human C-peptid efter glukose stimulation 1-9. Men in vitro, tilblivelsen af insulinproducerende celler fra humane føtale ICC er lav 10; resultater, der minder om de seneste forsøg udført med menneskelige embryonale stamceller (hESC), en vedvarende celler, der holder meget lovende som en potentiel terapeutisk behandling for type 1-diabetes. Ligesom ICC, transplantation af delvist differentieret hESC generere glukose lydhør, insulinproducerende celler, men in vitro tilblivelsen af insulinproducerende celler fra embryonale er langt mindre robust 11-17. En fuldstændig forståelse af de faktorer, der påvirker vækst og differentiering af endokrine precursorceller vil sandsynligvis kræve data genereret fra både ICC og HESC. Mens en række protokoller eksisterer for at generere insulinproducerende celler fra embryonale in vitro 11-22, langt færre findes for ICC 10,23,24. En del af denne forskel sandsynligvis kommer fra vanskeligheden ved at arbejde med humane føtale bugspytkirtlen. Mod det formål har vi fortsat med at bygge videre på de eksisterende metoder til at isolere fosterceller holme fra menneskelige bugspytkirtel med svangerskabsuge aldre varierende fra 12 til 23 uger, vokser cellerne som et monolag eller i suspension, og image for celleproliferation, pancreas markører og menneskelige hormoner herunder glucagon og C-peptid. ICC genereret af nedenfor beskrevne protokol resulterer i C-peptid frigivelse efter transplantation under nyrekapsel af nøgne mus, der ligner C-peptid-niveauer opnået ved transplantation af frisk væv 6. Selvom eksemplerne her fokuserer på pancreas endoderm spredning og β celle tilblivelse, kan protokollen anvendes til at studere andre aspekter af bugspytkirtlen udvikling, Herunder eksokrine, duktale og andre hormon-producerende celler.
Introduction
En primær begrænsning til cellebaserede insulin udskiftning behandlinger i type 1-diabetes er manglen på menneskelige holme til rådighed for transplantation. Evnen til at regulere proliferation og differentiering af humane pancreas præcursorceller i insulinproducerende celler, der opfylder de metaboliske krav fra en insulin-mangel tilstand er stadig et kritisk byggesten til en celle-baseret behandling til behandling af type 1 diabetes.
Indtil fremkomsten af embryonale afledt insulinproducerende celler, humane føtale pancreas endokrine celler eller deres forstadier blev betragtet som potentielle kilder til celler til klinisk transplantation. Selv om den videnskabelige og lovgivningsmæssige landskab har ændret sig i de seneste par år, er der stadig et afgørende behov for at forstå, hvordan den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikler sig. Mange nu se terapeutisk brug af menneskelige fosterceller som usandsynlig, men hvis effektive og sikre metoder til at udvide cellerne blev etableret, terapeutiske anvendelse af disse celler kunne again blive udforsket. En stor hurdle, der er tilbage er, at in vitro-transformation af humane føtale bugspytkirtelceller aggregater (ICCS) til glukose lydhør, insulinudskillende endokrine celler er i øjeblikket en ineffektiv proces. Selvom meget arbejde i løbet af næsten 30 år har belyst og afgrænset udtryk profilen af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for udviklingen af endokrine bugspytkirtel er der stadig huller i vores viden om, hvordan tidsmæssig udtryk for transkriptionsfaktorer er reguleret og relateret til celle funktion.
Indtil fremkomsten af embryonale afledt insulinproducerende celler, humane føtale pancreas endokrine celler eller deres forstadier blev betragtet som potentielle kilder til celler til klinisk transplantation. Selv om den videnskabelige og lovgivningsmæssige landskab har ændret sig i de seneste par år, er der stadig et afgørende behov for at forstå, hvordan den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikler sig. Mange nu se terapeutisk brug af menneskelige fosterceller som usandsynlig, men hvis effektivog sikre metoder til at udvide cellerne blev etableret, kan igen undersøges terapeutisk anvendelse af disse celler. En stor hurdle, der er tilbage er, at in vitro-transformation af humane føtale bugspytkirtelceller aggregater (ICCS) til glukose lydhør, insulinudskillende endokrine celler er i øjeblikket en ineffektiv proces. Selvom meget arbejde i løbet af næsten 30 år har belyst og afgrænset udtryk profilen af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for udviklingen af endokrine bugspytkirtel er der stadig huller i vores viden om, hvordan tidsmæssig udtryk for transkriptionsfaktorer er reguleret og relateret til celle funktion.
For nylig har inden stamceller anvendes den akkumulerede viden om tidsmæssig transkriptionsfaktor ekspression under ø udvikling til at drive produktion af celler, der udtrykker markører for modne endokrine celler. Selvom tilblivelse af insulinproducerende celler fra embryonale og inducerede pluripotente celler (IPSC) har gjort betydelige ogbetydelige fremskridt i de seneste par år, de mest effektive protokoller kræver to distinkte differentiering faser: 1) en tidlig in vitro differentiering til at generere celler, der udtrykker pancreas transskription forløber faktorer, efterfulgt af 2) in vivo modning efter transplantation - en såkaldt "black box "periode. For at komme videre, fremskridt i forståelsen af biologi underliggende holm modning in vivo, uanset cellekilde, skal forstås på et biokemisk niveau. Ligheden mellem de opnåede resultater med ICC og embryonale tyder på, at en række kritiske biokemiske processer, der regulerer overgangen af humane pancreas præcursorceller til modne, glucose lydhør, insulinudskillende celler in vitro forbliver ukendte. En central del af denne forståelse vil være at udvikle nye metoder til at udlede funktionelle endokrine cellepopulationer fra pancreasstamfaderceller og embryonale vil kræve ikke blot biokemisk caoaches der belyser modningen begivenheder, men metoder til at analysere ændringer.
Hvorfor tror vi, at billeddannelse humane føtale pancreas celler er et kritisk aspekt af at identificere ændringer i holmen modning? Svaret ligger delvist i den historiske søgen efter at generere insulinproducerende celler. Både model og vævs-kultur systemer for pancreas forstadier og holme har tilladt forskerne at udforske de betydelige forskelle, der eksisterer mellem modning af animalske holme og menneskelige holme in vitro. En begrænsning til udforskning af den menneskelige føtal bugspytkirtel udvikling er, at svangerskabsuge aldre, der lovligt kan anvendes kun giver anledning til heterogene celleaggregater. Selvom de isolerede føtale humane celler ligne holme, farvning efter in vitro kultur fra svangerskabsuge aldre 9-23 uger afslører mindre end 15% indeholder markører for endokrine celler, med de fleste celler ikke farvning for ø-hormoner. Men efter transplantation ogvivo modning, et stort flertal af celler udtrykker endokrine markører 6,25. Resultaterne fra disse undersøgelser er ved at blive gentaget i dag med embryonale differentiering protokoller, der kun er i stand til at generere beskedne bestande af enkelt hormon positive endokrine celler efter in vitro differentiering. In vitro metoder til at forbedre populationer af hormon positive celler vil sandsynligvis give indsigt i in vivo islet modning. Desuden at forstå de molekylære begivenheder, der driver den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikling vil sandsynligvis forbedre indsatsen for at udlede insulinproducerende celler fra embryonale og afgrænse de mekanismer, der regulerer β celle regenerering og pankreascelle transdifferentiation.
Lighederne mellem human føtal pankreascelle og embryonale modning kan udvides til cellefunktion. Ligesom murine celler, både humane føtale celler og differentierede embryonale er i stand til at frigive insulin som reaktion på glucoseefter ø neoformation in vitro 26,27. Men ved transplantation i nøgne mus og modning, både humane ø-lignende klynger og insulin-producerende celler afledt fra embryonale udviser en endokrin fænotype. Tre måneder efter podning, næsten 90% af de transplanterede celler fra enten befolkningen er insulin positive, og fungere normalt som bestemt af frigivelsen af C-peptid 17,26. Disse resultater indikerer, at transplantation giver kontekst og uidentificerede signaler, der fremmer ø modning. Optimeret imaging protokoller, såsom den er beskrevet her, for menneskerettighederne føtale bugspytkirtelceller vil støtte i søgningen til at identificere faktorer, der modulerer og fremskynde modning. Grundlæggende biokemisk udforskning af humane føtale pancreas celler og embryonale differentierede mod en endokrin afstamning i denne fase af udvikling er afgørende for at måle effektiviteten af modning.
Følgende protokol, som er skitseret i Figure1, giver vores nuværende metode til isolering af humane føtale pancreasceller, kaldet ICC fra hele human føtal bugspytkirtlen og billeddannelse af disse celler. Denne protokol kræver en indledende forberedelse af celler fra væv, som efterfølgende kan dyrkes som et monolag eller i suspension. Udarbejdelse af celler til billeddannelse af almindeligt anvendte markører for endokrin celledeling og modning er beskrevet.
Generation og billeddannelse af ICC i fraværet eller tilstedeværelsen af en række kemiske modificerende midler giver en hurtig metode, sammenlignet med transplantationsmodeller, at hjælpe med at identificere dyrkningsbetingelser og forbindelser, der fremskynder modning af humane føtale bugspytkirtlen celler i fuldt funktionel exokrint, duktalt, eller hormonproducerende pancreasceller.
Protocol
Noter før du går i gang:
- Humane føtale pancreata blev indhentet fra de fødselsdefekter Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), der høstede vævet. Informeret samtykke til væv donation, opbevaring og brug af prøverne blev opnået fra donorer ved centret. Protokollen samtykke erklæring blev gives skriftligt og University of California, San Diego Menneskelige Research Protections Program godkendt hele studie (Protokol # 081237XT).
- Det er vigtigt at opretholde både human føtal bugspytkirtlen og beholderen, der indeholder pancreas på is under hele proceduren. Dissociationen og fordøjelse skal udføres så hurtigt som muligt.
- Send klinikken, hvor human føtal pancreas blev opnået fra bufferen til opbevaring og transport af bugspytkirtlen. (RPMI-1640 + 10% normalt humant serum (NHS), 300 mM trehalose SG, penicillin / streptomycin og fungizon).
1.. Dissektion af humane føtale Pancreas
- Opløses 5 mg RT collagenase XI i HBSS til at give en endelig koncentration på 2,5 mg / ml. Filtersteriliser løsningen med en 0,22 mikron sprøjte filter over i en steril (autoklaveres) scintillationsglas og opbevares ved 4 ° C. I en vævskultur hætte, anført 2 sterile petriskåle, en steril lille digel (hvis en smeltedigel ikke er tilgængelig, kan et lille bæger erstattes), steriliseret saks og pincet. Tilsæt 2 ml HBSS til en petriskål til at vaske bugspytkirtlen. Aspirer væske fra rør, der indeholder de føtale bugspytkirtel, forlader omkring 1 ml.
- Fjern bugspytkirtlen med pincet til 60 mm petriskål uden HBSS. Til disse eksperimenter er føtale ICC'er genereres fra frisk pancreas med svangerskabsuge aldre spænder 9-23 uger. Isolering fra pancreas på tidligere gestionational aldre er vanskelig på grund af størrelsen af bugspytkirtlen. Protokollen er sandsynligvis gældende for svangerskabsuge aldre over 23 uger men erhvervelse af pancreata efter dette tidspunkt er vanskelig på grund af føderale (US) restriktioner. Lejlighedsvis, den føtale bugspytkirtlen ankommer med milten, fedt eller bindevæv fastgjort fra den oprindelige dissektion. Den ekstra væv er let synlig for det blotte øje og bør fjernes fra bugspytkirtlen, før du starter protokollen.
- Skyl bugspytkirtlen i en minimal mængde af kold HBSS (~ 0,5 ml) i petriskålen.
- Flyt de rengjorte bugspytkirtlen til den lille sterile smeltedigel med sterile pincetter og sted i en isspand. Anbring diglen i en holder til et 50 ml centrifugerør og ved hjælp af 2 sakse, energisk slice bugspytkirtlen i flere minutter. (Normalt 2-5 min, men den tid, afhænger af størrelsen og fastheden af væv). Kapningsteknik er vigtig. Hold den ene side af saksen i en fast position bevæger sig kun de modsatte håndtag. Spidsen af saksen skal hvile på bunden af diglen. Fortsæt med hurtig saks bevægelse til at bryde bugspytkirtlen i småstykker. Jo mindre stykker af væv, jo bedre collagenase vil arbejde.
- Tilføj 1,5 ml HBSS + de hakkede op bugspytkirtlen til hætteglasset indeholdende collagenase og sted i et vandbad shaker sæt til 37 ° C ved 200 rpm i op til 10 min. Kontroller ikke hyppigere end én gang i løbet af de første 5 min. Fordøjelse afhænger af vævet kvalitet, kan så lidt som 6 min være tilstrækkelig. Slutpunktet er, når partiklerne er små og ensartede.
- Fyld hætteglasset (10-15 ml) med kold HBSS at stoppe collagenase aktivitet. Placer på is og lade klumper til at nøjes med 10 min. Ofte på dette tidspunkt, har nogle celledød indtraf og DNA er frigivet i medierne. Dette kan gøre mediernes trævlet '; i dette tilfælde tilsættes 100 ul DNase (10 mg / ml stamopløsning) til opløsningen.
- Efter vævet i scintillationshætteglas har bundfældet i 10 minutter, aspirat fra det øverste lag forlader det lidt mindre end halvt fyldt (7-8 ml). Overfør cellerne til et 15 ml konisk rørTilsættes 5 ml HBSS. Centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer HBSS og cellerne resuspenderes i 5 ml medium indeholdende RPMI-1640, glutamax, 10% normalt humant serum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, penicillin / streptomycin og fungizone. Plade på 60 mm petriskål. For forskere forsøger at generere β celler, tilføje HGF (10 ng / ml endelig) til medierne. Derudover har en række grupper vist, at supplering af dyrkningsmedier med inkretinhormon GLP-1 øger også β celler 28. Cellerne bør overlades i en suspension i 72 timer at samle og danne ICC.
- Efter 72 timer i suspension kan celler udpladet på matrixen af den humane cellelinie HTB9 matrix som beskrevet tidligere 29.. Uanset vækstbetingelser bør medierne skiftes hver 48. time.
2.. Immunofluorescens af markører for Hormonforstyrrende celledeling og Modning i ICC Dyrket i suspension, monolag eller på dækglas
- Til måling af celleproliferation, er udført i 12 timer forud for PFA fiksering BrdU mærkning af enten adhærente celler eller celler i suspension. BrdU reagens fortyndet 1:100 og filtersteriliseret i RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES, pH 7,0, penicillin / streptomycin og fungizone.
- For celler i suspension: Centrifuger i 5 minutter ved 300 xg og aspirat dyrkningsmedium. Tilsæt 10 ml PBS til at vaske ICC, centrifuge i 5 minutter ved 300 xg og aspirat. Hvis ICC vil blive indlejret i paraffin, skal du følge valgfri protokol 3,1-3,17 For adhærente celler:. Fjern dyrkningsmedium og vaskes cellerne med PBS som beskrevet ovenfor. Lave celler i 20 min med 4% PFA ved stuetemperatur, og derefter vaskes to gange med PBS. På dette tidspunkt kan pladerne være indpakket med parafilm og opbevaret i PBS ved 4 ° C i op til 1 uge.
- Inkubér cellerne med 0,2% Triton-X 100 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne to gange med PBS og anvende blokeringsbuffer (2% gørenkey serum, 2% bovint serumalbumin, 50 mM glycin fortyndet i PBS) i 1 time. Vask cellerne med Working Buffer (Blocking Buffer fortyndet 1:10). Fortynd antistoffet i arbejde buffer. For celler dyrket på dækglas, fortyndes antistoffet i 60 ul totalvolumen. For celler i en 6-godt fad, fortyndes antistoffet i 600 ul samlede volumen. Til farvning af multiple epitoper, kan en cocktail af antistoffer, der skal anvendes. Som kontrol bruge IgG eller præ immune serum i stedet for det specifikke antistof. Kontrolprøver skal inkuberet med kontrol-IgG fra den samme art som det primære antistof, der anvendes.
- Inkubér primære antistof enten 1,5 time ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Aspirer det primære antistof og vask 3 x med Working buffer ved stuetemperatur.
- Fortynd det sekundære antistof ved 1:200 for Rhodamin og FITC konjugerede antistoffer, 1:500 - 1:1000 for Alexa konjugerede antistoffer. Det er vigtigt at bemærke, at alle sekundære antistoffer er lysfølsomme. Dæk prøvernei aluminium folie for at undgå tab af signal. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
EKSTRA: At visualisere kerner kan DAPI tilsættes på 1:500 under den sekundære inkubation. Dette er nyttigt til kvantificering af protein-ekspression i den samlede cellepopulation. - Aspirer det sekundære antistof og vask 3 x med Working buffer ved stuetemperatur. For celler dyrket på et dækglas, forsigtigt løfte dækglasset med en pincet, mens nedsænket i bufferen; vaske det ved at nedsænke i PBS. For celler dyrket i en 6-brønds plade tilsættes PBS til vaske og aspirat. På dette punkt er de klar til at undersøge under et inverteret mikroskop.
- Rører ved kanten af dækglasset forsigtigt på en Kimwipe at slippe af med overskydende PBS. Tilføj en dråbe montering gel på en glasplade og vend dækglasset på diaset. Fjern overskydende montage gel ved aspiration. Tryk dækglasset forsigtigt med bagsiden af en 200 ul pipettespids til at fjerne bobler.
- Tørt ved stuetemperatur i omkring 20 min eller O / N ved 4 ° C og undersøges under et fl, fluorescerende eller konfokal mikroskop.
3.. (Valgfrit) immunfluorescensfarvning af proteiner fra paraffinindlejret ICC'er
- Forbered en 3% agaroseopløsning og lad afkøle til 55-60 ° C.
- Overfør ICCs inkuberet i suspensionen til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 1500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer mediet fra cellerne, og fastgør med 500 pi 4% PFA i 10 min ved RT. Bland ikke pelleten medmindre pelleten er meget stort.
- Vask pellet to gange med 750 pi PBS. Ligesom de 4% PFA, er dette affald betragtes som farligt og skal bortskaffes i henhold til din institutions farligt specifikationer affald.
- Knips forsigtigt cellepelleten at løsne og tilføje 150-200 ul Agarosens ned væggen af 15 ml konisk rør.
- Bland ved forsigtigt at svirpe røret, men danner ikke bobler.
- Tillad at størkne ved 4 ° C i 5-10 min.
- Anvend en 21 G kanyle at løsnepillen og sted i en frisk 15 ml konisk rør.
- Paraffinfiksering og udarbejdelse af sektioner på dias kan gøres på stedet ved hjælp af en microtome eller ved din kerne mikroskopi faciliteter.
- Afparaffiner væv, hydrat, og vask med vand hurtigt.
- Tilsæt 0,2 M glycin i 30 min ved stuetemperatur for at standse den resterende aldehyd.
- Vask slide to gange med PBS i 2 minutter hver.
- For antigengenfinding bringe 10 mM citratbuffer (pH 6,0) for at koge over varmepladen. Fordyb dias i bufferen, vente på at komme tilbage til en byld, og vent 15 minutter.
- Derefter fjernes bægerglasset fra varmepladen. Vent ca 40 min for dias til afkøling i bufferen.
- Vask slides to gange med H 2 O i 5 min hver vaskes objektglassene to gange med PBS i 5 min hver, blok med 2% normalt æsel serum i PBS i 1 time.
- Inkuberes med primært antistof, fortyndet til en korrekt koncentration i Working buffer indeholdende 0,2% Triton X-100.Generelt er det primære antistof inkuberet natten over, hvis farvning for transkriptionsfaktorer og i 1,5 timer, hvis farvning for hormoner, markører af proliferation og / eller differentiering.
- Følg trin 2,3-2,9 beskrevet ovenfor.
Representative Results
Omhyggelig forberedelse af føtale ICC er afgørende for succes i denne protokol. Repræsentative billeder af, hvordan cellerne ser typisk ved definerede perioder efter udpladning er vist i figur 2. Efter oprensning frisk belagte celleaggregater vises som små, sparse klare klynger, der indeholder få celler (figur 2A). Efter de første 24 timer (figur 2B), mange af celleklynger bliver større, men mange små klynger tilbage. Ved 48 timer, har klyngerne udvidet betydeligt, men forbliver asymmetrisk (figur 2C). På 72 timer, bør ICC'er være klare, relativt ensartet i størrelse og form (figur 2D). Det er på dette punkt, at cellerne kan enten udpladet på matricer, såsom HTB-9, i 24 timer forud for immunfluorescens eller tillades at vokse i en anden 72 timer i fravær eller tilstedeværelse af kemikalier eller lægemidler, der kan ændre ekspressionen af gener kræves for pankreatisk endokrin celle generation. Figur 3 fremhæver en række almindeligt anvendte antistoffer til at vurdere enten ICC proliferation eller differentiering mod bugspytkirtlen endoderm. I figur 3A blev ICC'er udpladet på HTB-9, dyrket i 4 dage og farvet for PDX1 en kritisk markør for pancreas udvikling. Selvom in vitro-farvning af ICC udføres rutinemæssigt i vores laboratorium, oftere er humane føtale ICC'er transplanteret under nyre kapsel nøgne mus og lov til at formere sig og differentiere in vivo 6,9,30-32. På angivne tidspunkter efter transplantationen aflives musene, og nyren indeholder de transplanterede ICC er fjernet, fikseret i 4% paraformaldehyd, og indlejret i paraffin. Sekventielle 5-um snit genereres på stedet ved hjælp af en mikrotom eller en kerne mikroskopi facilitet. Epitop demaskering og farvning af proteiner fra paraffinindlejret væv til immunofluorescent mikroskopi er beskrevet i valgfri protokol 3,10-3.. 17. I figur 3B blev transplanteret ICC'er farvet med epitelcelle markør pan cytokeratin (PanCK, grøn) og Ki67 (rød) til at vurdere celleproliferation. I et andet eksempel blev både human insulin (grøn) og glucagon (rød) påvises efter transplantation og modning under nyrekapslen af en nøgen mus (figur 3C).
Figur 1.. Flow diagram af menneskelige føtal ICC forberedelse og farvning for Immunofluorescence.
Figur 2. Repræsentant føtal forberedelse ICC'er på 0, 24, 48 eller 72 timer efter udpladning. (A) ICC'eri suspension blev afbildet umiddelbart efter udpladning, (B) 24 timer efter udpladning, (C) 48 timer efter udpladning, eller (D) 72 timer efter udpladning. Målestokken for AC, 10X forstørrelse = 300 um, Målestokken for D, 20 forstørrelse = 100 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
.. Figur 3. Immunofluorescens af forgyldt ICC'er Rutinemæssigt ICC'er afbildet for (A) pancreas endoderm markør PDX1 (grøn), (B) endokrine celler (pan-CK, grøn) og spredning (Ki67, rød), (C) insulin (grøn) og glucagon (rød). Målestokken for AC, 40X forstørrelse = 20 um.
Discussion
De metoder, der præsenteres her, at man kan generere ICC fra humane føtale bugspytkirtel og efterfølgende billede for markører af celledeling og pancreas endoderm. Processen med human føtal pancreas dissociation kræves omkring 90 minutter, efterfulgt af en 72 timers ICC dannelse periode, en tilgang, der er væsentligt forskelligt fra protokoller til at isolere β celle stamceller fra mus. Protokollen præsenteres her tilvejebringer en reproducerbar metode, som gør det muligt for forskeren at undersøge human føtal pancreatisk udvikling. To forskellige typer af longitudinelle studier kan udføres. Først, kan den potentiale til at generere funktionelle pancreas celletyper (duktale celler, eksokrine celler og hormon positive celler) fra forskellige svangerskabsuge aldre vurderes efter transplantation. For det andet, kan ICC fra en enkelt gestationsalder dyrkes i kultur, behandlet med udvalgte farmakologiske midler og transplanteres på forskellige tidspunkter i løbet af ICC kultur at udforske forskellei celle skæbne. Med den store indsats i øjeblikket rettet mod embryonale differentiering til insulinproducerende celler er de problemer, der er forbundet med insulinsekretion som respons på fysiologiske stimuli igen blive genoplivet. Menneskelige ICC giver en unik model system til at studere denne kritiske aspekt af fosterets bugspytkirtel celledeling og β celle udvikling.
Som med enhver protokol til at isolere celler fra væv, detaljer er afgørende for succes. En række parametre er desværre uden for kontrol af laboratoriepersonale, der udfører eksperimentet. To problemer, som dette laboratorium omfatter dårlig kvalitet af udgangsmateriale og levering af ikke-bugspytkirtlen væv. Sund føtalt bugspytkirtlen væv er fast at en saks klippe. Hvis væv nedskæringer for let, er det et tegn på, at pancreas enzymer er begyndt at fordøje bugspytkirtlen selv. Fra dette er der desværre ingen nyttiggørelse og forberedelse er bedst annulleret. Sjældent, en ierfaren tekniker fjerne bugspytkirtlen vil forvirre dele af tarmen til bugspytkirtlen. Disse prøver har meget mere elasticitet end en bugspytkirtel og en bemærkelsesværdig lumen vil være til stede. Igen bør disse prøver kasseres.
Når ovenstående protokol følges som beskrevet, er der sjældent nogen problemer, der opstår at smide isolation af sporet. Et par punkter at huske at sikre en gnidningsløs isolation omfatter at bruge skarpe sakse til præcis bugspytkirtel opskæring og at sørge for at ikke efterlade nogen vævsprøve for stor til at fordøje. Såfremt udskæringer er ikke små nok, så collagenase ikke fungerer effektivt, og få ICC dannes. Omvendt, når du bruger et nyt parti af collagenase, starte med en tilsvarende niveau, hvis IE (internationale enheder) til fordøjelsen som tidligere anvendt. Imidlertid mindskes inkubationstiden for at sikre, at over fordøjelsen ikke forekommer. Denne fejlfinding teknik sikrer, at IE etiketten ikke varierer væsentligt fra parti til batch.
Taget i perspektiv, denne teknik til isolering af humane føtale ICC er forholdsvis standard inden for området. De fleste laboratorier bekræftede vores resultater, at tilsætning af HGF til mediet hjælper celler overlever og prolifererer 33. Sammenfattende har vi udviklet en metode til at isolere humane føtale ICC'er frisk pancreas med svangerskabsuge aldre spænder 9-23 uger. Cellerne kan dyrkes som et monolag eller i suspension til eksperimenter at visualisere pankreatiske endokrine transkriptionsfaktorer og humant insulin.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af California Institute for regenerativ medicin (RB3-02266) og NIH (DK54441).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
