Summary
פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.
Abstract
במשך כמעט 30 שנים, מדענים הוכיחו כי ICCS העוברי האנושי המושתל תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום הבשיל לתפקוד תאי המערכת האנדוקרינית, כפי שמעיד על ידי גידול משמעותי במחזור C-peptide אדם בעקבות גירוי גלוקוז 1-9. עם זאת במבחנה, בראשיתם של תאים המייצרים אינסולין מICCS העוברי האנושי היא 10 נמוכים; תוצאות מזכירות את הניסויים האחרונים בוצעו עם תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), מקור מתחדשת של תאים אשר מחזיקים הבטחה גדולה כטיפול טיפולי פוטנציאל לטיפול בסוכרת מהסוג 1. כמו ICCS, השתלה של hESC המובחן באופן חלקי לייצר, תאים המייצרים אינסולין גלוקוז מגיב, אבל בספר בראשית מבחנה של תאים המייצרים אינסולין מhESC היא הרבה פחות חזק 11-17. הבנה של הגורמים המשפיעים על הצמיחה וההתמיינות של תאים מבשר האנדוקרינית מלאה צפויה דורשים נתונים שנוצרו משני ICCS והואSC. בעוד במספר הפרוטוקולים קיימים כדי לייצר תאים המייצרים אינסולין מhESC במבחנה 11-22, הרבה פחות קיימת עבור ICCS 10,23,24. חלק מהפער שככל הנראה מגיע מהקושי של עבודה עם לבלב עוברי אנושי. לשם כך, אנו ממשיכים לבנות על שיטות קיימות לבודד את האיים מלבלב עובריים אנושי עם גילאי הריונית החל 12-23 שבועות, לגדל את התאים כmonolayer או בהשעיה, ותמונה להתפשטות תאים, סמני לבלב והורמונים אנושיים כולל גלוקגון ו-C-peptide. ICCS נוצר על ידי הפרוטוקול המתואר להלן תוצאה במהדורת C-peptide לאחר השתלה תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום שדומה לרמות C-peptide מתקבלות על ידי השתלה של רקמה טרי 6. למרות דוגמאות שהוצגו כאן מתמקדות בהתפשטות האנדודרם לבלב וראשית תא β, הפרוטוקול יכול להיות מועסק על מנת ללמוד היבטים אחרים של פיתוח לבלב, כולל אקסוקרינית, ductal, ותאי הורמון ייצור אחרים.
Introduction
מגבלה העיקרית להחלפת טיפולים מבוססי תאים לאינסולין בסוכרת מהסוג 1 היא מיעוט האיים אנושיים זמינים להשתלה. היכולת לווסת את הריבוי וההתמיינות של תאים מבשר לבלב אנושיים לתאים מייצרי אינסולין שלעמוד בדרישות המטבוליות של מדינת אינסולין לקוי נשארה אבן בניין חיונית לטיפול מבוסס תאים לטיפול בסוכרת מהסוג 1.
עד כניסתו של תאי hESC נגזרו מייצר אינסולין, תאים האנדוקרינית אנושיים עובריים בלבלב או המבשרים שלהם נתפסו כמקורות פוטנציאליים של תאים להשתלה קלינית. למרות הנוף המדעי ורגולציה השתנה בשנים האחרונות, יש עדיין צורך חיוני להבין כיצד הלבלב העוברי האנושי מתפתח. רבים כעת להציג שימוש טיפולי של תאים עובריים אנושיים כסביר, עם זאת, אם שיטות יעילות ובטוחות להרחיב את התאים הוקמו, שימוש טיפולי של תאים אלה יכול AGעין להיחקר. מכשול עיקרי שנותר הוא ששינוי במבחנה של אגרגטים אנושיים עובריים לתאי לבלב (ICCS) לגלוקוז מגיב, האינסולין המפריש תאים האנדוקרינית הוא כרגע תהליך לא יעיל. למרות עבודה הרבה במשך כמעט 30 שנים הובהרה והתוותה את פרופיל הביטוי של גורמי שעתוק הנדרשים לפיתוח לבלב האנדוקרינית, נותרו פערים בידע שלנו על איך ביטוי זמני של גורמי שעתוק מווסת וקשור לתפקוד תא.
עד כניסתו של תאי hESC נגזרו מייצר אינסולין, תאים האנדוקרינית אנושיים עובריים בלבלב או המבשרים שלהם נתפסו כמקורות פוטנציאליים של תאים להשתלה קלינית. למרות הנוף המדעי ורגולציה השתנה בשנים האחרונות, יש עדיין צורך חיוני להבין כיצד הלבלב העוברי האנושי מתפתח. רבים כעת להציג שימוש טיפולי של תאים עובריים אנושיים כסביר, עם זאת, אם יעילושיטות בטוחות כדי להרחיב את התאים הוקמו, שימוש טיפולי של תאים אלו יכולים שוב להיות חוקר. מכשול עיקרי שנותר הוא ששינוי במבחנה של אגרגטים אנושיים עובריים לתאי לבלב (ICCS) לגלוקוז מגיב, האינסולין המפריש תאים האנדוקרינית הוא כרגע תהליך לא יעיל. למרות עבודה הרבה במשך כמעט 30 שנים הובהרה והתוותה את פרופיל הביטוי של גורמי שעתוק הנדרשים לפיתוח לבלב האנדוקרינית, נותרו פערים בידע שלנו על איך ביטוי זמני של גורמי שעתוק מווסת וקשור לתפקוד תא.
לאחרונה, בתחום תאי גזע העסיק את הידע שנצבר על ביטוי גורם שעתוק זמני במהלך התפתחות איון לנהוג הייצור של תאים המבטאים את הסמנים של תאים האנדוקרינית בוגרים. למרות שראשיתו של תאים המייצרים אינסולין מhESC ותאי pluripotent מושרה (iPSC) הפכה משמעותית והתקדמות משמעותית בשנים האחרונות, הפרוטוקולים היעילים ביותר דורשים שני שלבי בידול ברורים: 1) בידול מוקדם במבחנה כדי לייצר תאים לבטא גורמי שעתוק לבלב מבשר, ואחרי 2) התבגרות in vivo לאחר השתלה - "קופסא שחורה שנקרא "תקופה. כדי לנוע קדימה, התקדמות בהבנת התבגרות איון הבסיסית הביולוגיה in vivo, ללא קשר למקור תא, חייב להיות מובן ברמה הביוכימית. הדמיון בין התוצאות שהושגו עם ICCS וhESC עולה כי מספר התהליכים ביוכימיים קריטיים המסדירים את המעבר של תאים מבשר לבלב אנושיים לתאים בוגרים, גלוקוז מגיבים, אינסולין מפריש במבחנה אינה ידוע. חלק מהבנה זו מרכזי יהיה לפתח שיטות חדשניות לנובע אוכלוסיות תאים האנדוקרינית פונקציונליות מתאי לבלב וhESC יחייב לא רק appr ביוכימייםoaches שלהבהיר את אירועי התבגרות, אבל שיטות כדי לנתח את השינויים.
מדוע אנו מאמינים כי הדמיה תאי לבלב עובריים אנושיים היא היבט קריטי של זיהוי שינויים בהתבגרות איון? התשובה נעוצה בחלקו במסע ההיסטורי ליצירת תאים המייצרים אינסולין. דגם שני ומערכות רקמות תרבות למבשרים ואיי לבלב אפשרו לחוקרים לחקור את ההבדלים המשמעותיים הקיימים בין ההבשלה של איונים בעלי חיים ואיי אדם במבחנה. הגבלה לחקר התפתחות לבלב בעובר האנושית היא שגילי ההריון שניתן להשתמש באופן חוקי לתת רק עלייה לאגרגטים תא הטרוגנית. למרות שהתאים האנושיים העובריים המבודדים הדומים לאיים, מכתים אחרי תרבות במבחנה מגיל הריון 9-23 שבועות מגלה פחות מ 15% מכילים סמנים לתאים האנדוקרינית, עם רוב התאים אינו מכתימים את הורמוני איון. עם זאת, לאחר השתלה ובvivo התבגרות, ברוב גדול של תאים לבטא את הסמנים האנדוקרינית 6,25. התוצאות ממחקרים אלה נמצאים בהדהדו היום עם פרוטוקולי בידול hESC כי הם רק מסוגלים ליצור אוכלוסיות צנועות של תאים האנדוקרינית חיוביים הורמון אחד לאחר במבחנה בידול במבחנה שיטות. כדי לשפר את האוכלוסיות של תאי הורמון חיובי צפויות לספק תובנות לגבי איון in vivo התבגרות. יתר על כן, להבנת האירועים המולקולריים המניעים את התפתחות לבלב בעובר אנושית צפויה לשפר את המאמצים להפקת תאים המייצרים אינסולין מhESC ועוד יותר לשרטט את המנגנונים המווסתים את התחדשות תאי β וtransdifferentiation תא לבלב.
הדמיון בין תא האנושי עוברי בלבלב והתבגרות hESC יכול להתארך לתפקוד תא. כמו תאי Murine, שני תאים עובריים אנושיים וhESC המובחן אינם מסוגלים לשחרר אינסולין בתגובה לגלוקוזלאחר neoformation איון במבחנה 26,27. עם זאת, על השתלה בעכברים בעירום והתבגרות, שני אשכולות כמו איון אנושי ותאים המייצרים אינסולין הנגזרים מתערוכת hESC פנוטיפ האנדוקרינית. שלושה חודשים לאחר ההשתלה, כמעט 90% מהתאים המושתלים משתי אוכלוסייה הם אינסולין חיובי, ולתפקד באופן נורמלי, כפי שנקבעו על ידי שחרורו של 17,26 C-peptide. תוצאות אלו מצביעות על כך שההשתלה מספקת רמזי הקשר ובלתי מזוהים המקדמים התבגרות איון. פרוטוקולים מותאמים הדמיה, כגון זה שתואר כאן, לתאי לבלב עובריים אנושיים יסייעו בחיפוש כדי לזהות גורמים המווסתים ולהאיץ את ההבשלה. חיפושים ביוכימיים בסיסיים של תאים אנושיים עובריים בלבלב וhESC המובחן כלפי שושלת האנדוקרינית בשלב זה של פיתוח הוא חיוניים למדידת יעילות של התבגרות.
הפרוטוקול הבא, המפורטים בfigurדואר 1, מספק השיטה הנוכחית שלנו לבידוד של תאי לבלב עובריים אנושיים, שנקרא ICCS מהלבלב כולו אנושי של העובר וההדמיה של תאים אלה. פרוטוקול זה דורש הכנה ראשונית של תאים מהרקמה, שניתן לגדל בהמשך כmonolayer או בהשעיה. הכנת תאים להדמיה של סמנים נפוצים של התפשטות תאים האנדוקרינית והתבגרות מתוארת.
דור והדמיה של ICCS בהעדר או הנוכחות של מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי מספק שיטה מהירה, בהשוואה למודלי השתלה, כדי לסייע בזיהוי תנאי תרבות ותרכובות הסייע בהאצת הבשלה של תאי לבלב עובריים אנושיים לאקסוקרינית מתפקד במלואה, ductal, או הורמון ייצור תאי לבלב.
Protocol
הערות לפני תחילת העבודה:
- pancreata העוברי האנושי התקבלו מהמומים המולדים במעבדת מחקר, באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון, ארה"ב) שנקטפה הרקמות. הסכמה מדעת לתרומת רקמות, אחסון ושימוש בדגימות שהתקבלה מהתורמים על ידי המרכז. שמירה על הסכמת הפרוטוקול נמסרה בכתב ובאוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו תכנית גידור המחקר האנושי אישרה את המחקר כולו (פרוטוקול # 081237XT).
- זה חיוני כדי לשמור על שניהם בלבלב עוברי האנושי והמכל מחזיק לבלב על קרח במהלך ההליך כולו. דיסוציאציה והעיכול צריכה להתבצע מהר ככל האפשר.
- שלח את המרפאה שבו הלבלב העוברי האנושי התקבל מהמאגר לאחסון והובלה של הלבלב. (RPMI-1640 10% בסרום אדם נורמלי + (NHS), SG trehalose 300 מ"מ, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone).
1. Dissection של לבלב עוברי אדם
- ממיסים 5 מ"ג XI collagenase RT בHBSS לתת ריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מיליליטר. סנן לעקר את הפתרון עם מסנן מזרק 0.22 מיקרון לתוך בקבוקון סטרילי (autoclaved) נצנץ ולאחסן ב 4 ° C. במכסת מנוע בתרבית רקמה, יצא 2 מנות סטרילי פטרי, כור היתוך סטרילי קטן (אם כור היתוך אינו זמין, כוס קטנה ניתן להחליף), מספריים מעוקרים, ומלקחיים. הוסף 2 מיליליטר HBSS לאחד צלחת פטרי כדי לשטוף את הלבלב. נוזל לשאוב מהצינור המכיל את הלבלב בעובר, ומשאיר כ 1 מיליליטר.
- הסר את הלבלב עם מלקחיים לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ ללא HBSS. בניסויים אלה, ICCS העוברי מופקים מpancreata הטרי עם גילאי הריונית החל 9-23 שבועות. בידוד מpancreata בגילי gestionational קודם לכן קשה בגלל הגודל של הלבלב. הפרוטוקול צפוי החלים על גילאי הריונית מעבר 23 שבועות, לעומת זאת רכישה של pancreata אחרי כל הזמן הזה הוא קשה בגלל הגבלות פדרליות (ארה"ב). לפעמים, הלבלב העוברי מגיע עם הטחול, שומן, או רקמת חיבור המחוברים לנתיחה המקורית. הרקמה נוספת היא נראה בקלות בעין בלתי מזוינת, ויש להסיר מהלבלב לפני שמתחיל את הפרוטוקול.
- יש לשטוף את הלבלב בנפח מינימאלי של HBSS הקר (~ 0.5 מיליליטר) בצלחת פטרי.
- הזז את הלבלב ניקה לכור היתוך סטרילי הקטן באמצעות מלקחיים ומקום סטרילי בדלי קרח. הנח את כור ההיתוך בבעל לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, ובאמצעות 2 זוגות מספריים, במרץ פורס את הלבלב במשך כמה דקות. (בדרך כלל 2-5 דקות, אבל הזמן תלוי בגודל והמוצקות של הרקמה). חיתוך טכניקה הוא חשוב. מחזיק צד אחד של המספריים בתנוחה קבועה נעה רק ידיות הפוכות. הטיפים של המספריים צריכים לנוח על החלק התחתון של כור ההיתוך. המשך עם תנועת מספריים מהירה לשבור את הלבלב לקטןחתיכות. פיסות רקמה קטנה יותר, טוב יותר collagenase יעבוד.
- הוסף 1.5 מיליליטר של HBSS + הלבלב הקצוץ עד לבקבוקון המכיל collagenase ומקום בסט שייקר אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס בסל"ד 200 עד 10 דקות. אל תבדקו בתדירות גבוהה יותר מפעם אחת במהלך 5 דקות הראשונות. זמן עיכול תלוי באיכות הרקמות, קטן כמו 6 דקות עשויות להיות מספיק. נקודת הסיום היא כאשר החלקיקים קטנים ואחיד.
- מלא את הבקבוקון (10-15 מיליליטר) עם HBSS הקר כדי לעצור את פעילות collagenase. מניחים על קרח ולאפשר לגושים להסתפק 10 דקות. לעתים קרובות, בשלב זה, חלק מהמוות של תאים שחל ו-DNA משתחרר לתקשורת. זה יכול להפוך את התקשורת 'סיבי'; במקרה זה, להוסיף 100 DNase μl (10 מ"ג / מיליליטר מניות) לפתרון.
- לאחר הרקמה בבקבוקון הנצנץ יש התיישבה ל10 דקות, לשאוב את השכבה העליונה ומותירה אותו מעט פחות מחצי מלא (7-8 מיליליטר). להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף 5 מיליליטר HBSS. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב300 x גרם.
- לשאוב HBSS ו resuspend התאים ב 5 מיליליטר מדיה המכילה RPMI-1640, Glutamax, 10% בסרום נורמלי אנושי (NHS), 10 HEPES מ"מ pH 7.2, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone. צלחת על 60 מ"מ צלחת פטרי. עבור חוקרים מנסים לייצר תאי β, להוסיף HGF (10 ng / ml הסופי) לתקשורת. בנוסף, מספר הקבוצות הראו כי תוספת של התקשורת בתרבות עם הורמון אינקרטין GLP-1 גם מגביר תאי β 28. יש להשאיר תאים בתרחיף ל72 שעות כדי לצבור וליצור ICCS.
- לאחר 72 שעות בהשעיה, יכולים להיות מצופים תאים במטריצה של מטריצת HTB9 שורת תאים האנושית כפי שתואר לעיל 29. ללא קשר לתנאי גידול, יש לשנות את התקשורת בכל שעות 48.
2. Immunofluorescence של סמנים של התפשטות תאים האנדוקרינית והתבגרות בICCS גדל בהשעיה, חד שכבתי, או על coverslips זכוכית
- כדי למדוד את התפשטות תאים, תיוג BrdU של שני תאים או תאים חסיד בהשעיה מבוצע ל12 שעות לפני קיבוע PFA. מגיב BrdU מדולל 1:100 ומסנן מעוקר RPMI-1640, Glutamax, 10% NHS, 10 HEPES מ"מ pH 7.0, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone.
- לתאים בתרחיף: צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 ובינוני תרבות לשאוב. הוסף 10 מיליליטר PBS לשטוף ICCS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 300 ולשאוב. אם ICCS הולך להיות מוטבע בפרפין, אנא עקוב אחר פרוטוקול אופציונלי 3.1-3.17 לתאים חסיד:. הסר בינוני תרבות ולשטוף תאים עם PBS, כמתואר לעיל. תקן את התאים עבור 20 דקות עם PFA 4% ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. בשלב זה, יכולה להיות עטוף צלחות עם Parafilm ומאוחסנות בPBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך השבוע עד 1.
- דגירה התאים עם 0.2% Triton-X 100 PBS במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהחיל חסימת מאגר (2% לעשותסרום n מפתחות, 2% אלבומין בסרום שור, 50 מ"מ גליצין מדוללים PBS) במשך שעה 1. לשטוף את התאים עם עבודה חוצץ (חסימת החיץ מדולל 1:10). לדלל את הנוגדן במאגר עובד. לתאים גדלו על coverslips זכוכית, לדלל את הנוגדן ב60 נפח כולל μl. לתאים בצלחת 6 היטב, לדלל את הנוגדן ב600 נפח כולל μl. כדי להכתים אפיטופים מרובים, קוקטייל של נוגדנים עשוי להיות מיושם. כביקורת, השתמש IgG או מראש סרום חיסוניים במקום של הנוגדן הספציפי. דגימות בקרה חייבת להיות הודגרו עם IgG שליטה מאותו המין כמו בשימוש הנוגדן הראשוני.
- דגירה הנוגדן הראשוני או שעה 1.5 ב RT או O / N ב 4 ° C. לשאוב את הנוגדן הראשוני ולשטוף 3x עם העבודה הצפת ב RT.
- לדלל את הנוגדנים משני ב1:200 לנוגדנים מצומדות Rhodamine וFITC, 1:500 - 1:1,000 לנוגדנים מצומדות אלקסה. חשוב לציין כי כל הנוגדנים משני הם רגישים לאור. כסה את הדגימותבנייר אלומיניום כדי למנוע אובדן של אות. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
אופציונלי: כדי להמחיש את הגרעינים, ניתן להוסיף DAPI ב1:500 במהלך הדגירה המשנית. זה שימושי כדי לכמת את ביטוי חלבון בסך הכל אוכלוסיית התא. - לשאוב משני הנוגדנים ולשטוף 3x עם העבודה הצפת ב RT. לתאים שגודל על coverslip, בעדינות להרים את coverslip עם מלקחיים תוך שקוע במאגר; לשטוף אותו על ידי טבילה ב-PBS. לתאים שגודלו בצלחת 6 היטב, להוסיף PBS לשטוף ולשאוב. בשלב זה הם מוכנים לבחון תחת מיקרוסקופ הפוכה.
- לגעת בקצה coverslip בעדינות על Kimwipe להיפטר של PBS העודף. הוסף טיפה של ג'ל הרכבה בשקופית זכוכית ולהפוך את coverslip לשקופית. הסר ג'ל הרכבה העודף על ידי שאיפה. הקש על coverslip בעדינות בגב טיפ 200 pipet μl כדי להסיר בועות.
- יבש בטמפרטורת החדר למשך כ -20 דקות או O / N ב 4 ° C ולבדוק תחת fluorescent או מיקרוסקופ confocal.
3. Immunofluorescent מכתים (אופציונאלי) של חלבונים מICCS המוטבע פרפין
- הכן את פתרון agarose 3% ולתת מגניב ל55-60 ° C.
- העבר ICCS מודגרות בהשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 1,500 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשאוב את התקשורת מהתאים ולתקן עם 500 μl PFA 4% ל10 דקות ב RT. אל תערבב את הכדור, אלא אם כן את גלולה היא גדולה מאוד.
- שטוף את הכדור פעמיים עם 750 μl PBS. כמו PFA 4%, פסולת זו נחשבת מסוכנת וצריכה להיות מסולק על פי המפרט של הפסולת מסוכנת של המוסד שלך.
- בעדינות קפיצית התא גלולה כדי לשחרר ולהוסיף 150-200 μl של agarose במורד הקיר של צינור חרוטי 15 מיליליטר.
- מערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינור, אך לא יוצר בועות.
- תאפשר לבסס על 4 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- שימוש במחט 21 G כדי לסלקגלולה והמקום בצינור חרוטי 15 מיליליטר טרי.
- הטבעת פרפין והכנת סעיפים בשקופיות ניתן לעשות באתר באמצעות microtome או על ידי המתקנים מיקרוסקופית הליבה שלך.
- Deparaffinize רקמות, מימה, ולשטוף עם מים במהירות.
- הוספת גליצין 0.2 M עבור 30 דקות ב RT כדי להרוות את אלדהיד הנותר.
- שטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 2 דקות כל אחד.
- לאחזור אנטיגן, להביא 10 מ"מ ציטראט חוצץ (pH 6.0) לרתיחה מעל צלחת חמה. לטבול את השקופיות בחיץ, לחכות שיבואו אותו בחזרה לרתיחה, ולחכות ל15 דקות.
- הסר את הכוס מהפלטה החשמלית. המתן כ40 דקות לשקופיות להתקרר במאגר.
- שטוף את השקופיות פעמיים עם H 2 O למשך 5 דקות כל אחד, לשטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, לחסום עם 2% סרום חמור נורמלי ב-PBS במשך שעה 1.
- דגירה עם נוגדן ראשוני, מדולל לריכוז נכון בעבודת מאגר המכיל 0.2% טריטון X-100.באופן כללי, הנוגדן הראשוני הוא מודגרות לילה אם מכתים את גורמי שעתוק ול1.5 שעות אם מכתים את הורמונים, סמנים של התפשטות, ו / או בידול.
- בצע את הפעולות 2.3-2.9 שתוארו לעיל.
Representative Results
הכנה קפדנית של ICCS העוברי היא קריטית להצלחתו של פרוטוקול זה. תמונות מייצגות של כמה התאים בדרך כלל מסתכלים על תקופות מוגדרות לאחר ציפוי מוצגות באיור 2. לאחר טיהור, אגרגטים התא טרי מצופים מופיעים צבירים קטנים, דלילים ברורים המכילים מספר תאים (איור 2 א). לאחר 24 שעות הראשונות (איור 2), שרבים מצבירי התאים להפוך לגדולים יותר, אך בקבוצות קטנות רבות להישאר. על ידי 48 שעות, האשכולות הרחיבו באופן משמעותי, אך יישארו לא סימטרי (איור 2 ג). ב72 שעה, ICCS צריך להיות ברור, אחיד יחסית בגודל ובצורה (איור 2 ד). זה בשלב זה כי התאים יכולים להיות מצופים או על מטריצות, כגון HTB-9, ל24 שעות לפני immunofluorescence או מותר לגדל עוד 72 שעות בהעדר או הנוכחות של כימיקלים או תרופות שעשויות לשנות את הביטוי של גנים הנדרש לגרם תא האנדוקרינית של לבלבeneration. איור 3 מדגיש מספר הנוגדנים משמשים בדרך כלל כדי להעריך או התפשטות ICC או בידול כלפי האנדודרם לבלב. באיור 3 א, ICCS היו מצופה על HTB-9, גדל במשך 4 ימים, ומוכתם עבור PDX1, סמן קריטי של התפתחות לבלב. למרות שצביעה במבחנה של ICCS מבוצעת באופן שיגרתי במעבדה שלנו, לעתים קרובות יותר, ICCS העוברי האנושי מושתלים תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום והם יכולים להתרבות ולהבדיל in vivo 6,9,30-32. בזמנים שצוינו לאחר השתלה, עכברים הקריבו והכליות המכילות ICCS המושתל מוסרות, קבוע paraformaldehyde 4%, ומשובץ בפרפין. סעיפי 5-מיקרומטר רציפים נוצרים או באתר באמצעות microtome או על ידי מתקן מיקרוסקופית ליבה. הסרת מסכות Epitope וצביעה של חלבונים מרקמות פרפין המוטבעים למיקרוסקופיה immunofluorescent מתוארים בפרוטוקול אופציונלי 3.10-3.. 17 באיור 3 ב, ICCS המושתל הוכתמו cytokeratin אפיתל סמן תא המחבת (PanCK; ירוקה) ועם Ki67 (אדום) כדי להעריך את התפשטות תאים. בדוגמא נוספת, הן אינסולין אנושי (ירוק) וגלוקגון (אדום) התגלו לאחר השתלה והתבגרות תחת הקפסולה הכליות של עכבר בעירום (איור 3 ג).
איור 1. תרשים זרימה של הכנה אנושית העובר כאל וצביעה לImmunofluorescence.
איור 2. הכנת נציג עוברית ICCS ב 0, 24, 48, או 72 שעות לאחר ציפוי. ICCS ()השעיה היו צילמו מייד לאחר ציפוי, 24 שעות (ב ') לאחר ציפוי, שעה (C) 48 לאחר ציפוי, או 72 שעות לאחר ציפוי (ד'). סרגל קנה מידה עבור AC, הגדלה 10X = 300 מיקרומטר, סרגל קנה מידה עבור D, 20 הגדלה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.. איור 3 Immunofluorescence של ICCS המצופה באופן שגרתי, ICCS הם צילמו ל() PDX1 הסמן האנדודרם לבלב (הירוק), תאים (B) האנדוקרינית אינסולין, (ג) (פאן CK;; ירוק) והתפשטות (אדום Ki67) (ירוק) וגלוקגון (אדום). סרגל קנה מידה עבור AC, הגדלה 40X = 20 מיקרומטר.
Discussion
השיטות שהוצגו כאן מאפשרות לאדם ליצור ICCS מלבלב אנושי עוברי ולאחר מכן תמונה עבור סמנים של התפשטות תאים והאנדודרם לבלב. התהליך של ניתוק לבלב עוברי אנושי הנדרש על 90 דקות, ואחרי תקופת היווצרות ICC 72 שעה, גישה שהיא שונה באופן מהותי מפרוטוקולים לבודד את תאי אב של תאי β מעכבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה לשחזור שמאפשרת לחוקר לחקור התפתחות לבלב בעובר אנושית. שני סוגים שונים של מחקרים ארוכי טווח יכולים להתבצע. ראשית, הפוטנציאל ליצור סוגים תפקודיים לבלב תאים (תאי ductal, תאים אקסוקרינית, ותאים חיוביים הורמון) מגיל הריון שונה ניתן להעריך לאחר השתלה. שנית, ניתן לגדל ICCS מגיל הריון יחיד בתרבות, שטופל עם סוכנים תרופתיים שנבחרו ומושתל בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ICC לחקור הבדליםבגורל תא. במאמצים הכבירים שכעת מופנים כלפי בידול hESC לתאים המייצרים אינסולין, הבעיות הקשורות להפרשת אינסולין בתגובה לגירויים פיסיולוגיים שוב לתחייה. ICCS אדם לספק מערכת מודל ייחודית ללמוד היבט קריטי זה של ריבוי עוברי לבלב תאים והתפתחות תא β.
כמו עם כל פרוטוקול לבודד תאים מרקמות, פרטים הם קריטיים להצלחה. מספר הפרמטרים הם לצערי מחוץ לשליטה של אנשי המעבדה מבצעים את הניסוי. שתי בעיות שבם נתקלו במעבדה זו כוללות איכות ירודה של חומר המוצא ומסירה של רקמה שאינה לבלב. רקמת לבלב עוברית בריאה היא חברה לקיצוץ מספריים. אם החתכים הרקמה בקלות מדי, זה סימן לכך שאנזימי הלבלב החלו לעכל את הלבלב עצמו. מכאן שיש לצערי אין התאוששות וההכנה מבוטלת הטוב ביותר. לעתים רחוקות, בטכנאי מנוסה הסרת הלבלב יבלבל את החלקים של המעי ללבלב. דגימות אלה תהיה הרבה יותר גמישות מאשר לבלב ולומן בולט יהיה נוכח. שוב, צריכה להיות מושלכות דגימות אלה.
כאשר הפרוטוקול לעיל ואחריו כפי שתואר, יש לעתים נדירות כל בעיות המתעוררות לזרוק את הבידוד מחוץ למסלול. כמה נקודות שיש לזכור כדי להבטיח בידוד חלק כוללות, להשתמש במספריים חדים לחיתוך מדויק ולבלב כדי לוודא שלא לעזוב כל דגימת רקמה גדולה מדי לעיכול. אם הקיצוץ לא קטן מספיק, אז collagenase לא עובד בצורה יעילה, וכמה ICCS נוצרים. לעומת זאת, כאשר משתמש בקבוצה חדשה של collagenase, להתחיל עם רמה דומה אם IU (יחידות בינלאומיות) לעיכול כמו בשימוש בעבר. עם זאת, ירידה בזמן הדגירה על מנת להבטיח כי מעל העיכול אינו מתרחש. טכניקה לפתרון בעיות זה מבטיחה שתווית יחב"ל אינה משתנות באופן משמעותי מיצוו לתואר ראשוןטצ.
צילום בפרספקטיבה, טכניקה זו לבידודה של ICCS העוברי האנושי היא סטנדרטית יחסית בתחום. רוב המעבדות אישרו את הממצאים שלנו, כי תוספת של HGF לתקשורת מסייעת לתאים לשרוד ולהתרבות 33. לסיכום, פיתחנו שיטה לבודד ICCS העוברי האנושי pancreata הטרי עם גילאי הריונית החל 9-23 שבועות. ניתן לגדל התאים כmonolayer או בהשעיה לניסויים כדי להמחיש גורמי שעתוק האנדוקרינית לבלב ואינסולין אנושי.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (RB3-02,266) ו-NIH (DK54441).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
