Summary
अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल, मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं से व्युत्पन्न संस्कृति, और छवि आइलेट सेल समूहों (ICC देखने) में वर्णित है. विधि ऊतक, संस्कृति monolayers के रूप में या समुच्चय के रूप में निलंबन में, और प्रसार के मार्कर और अग्नाशय सेल भाग्य के फैसले के लिए छवि से ICC देखने उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम विवरण देता है.
Abstract
लगभग 30 वर्षों के लिए, वैज्ञानिकों ग्लूकोज उत्तेजना 1-9 निम्नलिखित मानव सी पेप्टाइड प्रचलन में उल्लेखनीय वृद्धि के सबूत के रूप नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपित मानव भ्रूण ICC देखने, अंत: स्रावी कोशिकाओं कामकाज में परिपक्व हो कि प्रदर्शन किया है. हालांकि इन विट्रो में, मानव भ्रूण ICC देखने से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की उत्पत्ति कम 10 है; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) के साथ प्रदर्शन किया हाल के प्रयोगों की याद ताजा परिणाम, टाइप 1 मधुमेह के लिए एक संभावित चिकित्सीय उपचार के रूप में महान वादा पकड़ कि कोशिकाओं का एक अक्षय स्रोत है. ICC देखने की तरह, आंशिक रूप से भेदभाव कर hESC का प्रत्यारोपण ग्लूकोज उत्तरदायी, इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न, लेकिन hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की इन विट्रो उत्पत्ति में बहुत कम मजबूत 11-17 है. अंत: स्रावी अग्रदूत साबित कोशिकाओं के विकास और भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों की एक पूरी समझ होने की संभावना डेटा ICC देखने और वह दोनों से उत्पन्न की आवश्यकता होगीअनुसूचित जाति. प्रोटोकॉल के एक नंबर के लिए इन विट्रो 11-22, ICC देखने 10,23,24 के लिए अब तक कम अस्तित्व में hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मौजूद हैं. कि विसंगति का हिस्सा होने की संभावना मानव भ्रूण अग्न्याशय के साथ काम करने की कठिनाई से आता है. कि अंत में हम लेकर गर्भावधि उम्र के साथ मानव pancreases से भ्रूण टापू अलग करने के लिए मौजूदा तरीकों पर निर्माण जारी रखा है 12 से 23 सप्ताह से, एक monolayer के रूप में या निलंबन में कोशिकाओं के विकास, और सेल प्रसार, अग्नाशय मार्करों और मानव हार्मोन के लिए छवि ग्लूकागन और सी पेप्टाइड सहित. ICC देखने ताजा ऊतक 6 के प्रत्यारोपण द्वारा प्राप्त सी पेप्टाइड के स्तर के समान हैं कि नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण के बाद सी पेप्टाइड रिहाई में परिणाम नीचे वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण अग्नाशय अन्तर्जनस्तर प्रसार और β सेल उत्पत्ति पर ध्यान केंद्रित हालांकि, प्रोटोकॉल अग्नाशय के विकास के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, बहि, वाहिनीपरक, और अन्य हार्मोन का उत्पादन कोशिकाओं सहित.
Introduction
टाइप 1 मधुमेह में सेल आधारित इंसुलिन प्रतिस्थापन उपचार के लिए एक प्राथमिक सीमा प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध मानव islets की कमी है. एक इंसुलिन की कमी राज्य की चयापचय की मांग को पूरा करने वाले इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में मानव अग्नाशय के अग्रदूत साबित कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव को विनियमित करने की क्षमता टाइप 1 मधुमेह के इलाज के लिए एक सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक बनी हुई है.
HESC व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं, मानव भ्रूण अग्नाशय के अंत: स्रावी कोशिकाओं या उनके पूर्ववर्ती के आगमन के नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं के संभावित स्रोतों के रूप में देखा गया है जब तक. वैज्ञानिक और विनियामक परिदृश्य पिछले कुछ वर्षों में बदल गया है, मानव भ्रूण अग्न्याशय विकसित करता है समझने के लिए कैसे एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है. कई अब कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए प्रभावी और सुरक्षित तरीके स्थापित किए गए थे, तो संभावना नहीं है, हालांकि, इन कोशिकाओं के चिकित्सीय उपयोग एजी सकता के रूप में मानव भ्रूण कोशिकाओं की चिकित्सकीय प्रयोग देखनेपता लगाया जा ऐन. बनी हुई है कि एक प्रमुख बाधा उत्तरदायी ग्लूकोज में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं समुच्चय (ICC देखने) के इन विट्रो परिवर्तन में, अंत: स्रावी कोशिकाओं स्रावित इंसुलिन वर्तमान में एक अकुशल प्रक्रिया है. ज्यादा काम पर लगभग 30 साल elucidated और अंत: स्रावी अग्न्याशय के विकास के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चित्रित किया गया है, अंतराल प्रतिलेखन कारक के अस्थायी अभिव्यक्ति विनियमित और सेल समारोह से संबंधित है के बारे में हमारे ज्ञान में वहाँ रहते हैं.
HESC व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं, मानव भ्रूण अग्नाशय के अंत: स्रावी कोशिकाओं या उनके पूर्ववर्ती के आगमन के नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं के संभावित स्रोतों के रूप में देखा गया है जब तक. वैज्ञानिक और विनियामक परिदृश्य पिछले कुछ वर्षों में बदल गया है, मानव भ्रूण अग्न्याशय विकसित करता है समझने के लिए कैसे एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है. कई अब, लेकिन अगर प्रभावी संभावना नहीं के रूप में मानव भ्रूण कोशिकाओं की चिकित्सकीय प्रयोग देखनेऔर कोशिकाओं स्थापित किए गए थे विस्तार करने के लिए सुरक्षित तरीके, इन कोशिकाओं के चिकित्सीय उपयोग फिर से पता लगाया जा सकता है. बनी हुई है कि एक प्रमुख बाधा उत्तरदायी ग्लूकोज में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं समुच्चय (ICC देखने) के इन विट्रो परिवर्तन में, अंत: स्रावी कोशिकाओं स्रावित इंसुलिन वर्तमान में एक अकुशल प्रक्रिया है. ज्यादा काम पर लगभग 30 साल elucidated और अंत: स्रावी अग्न्याशय के विकास के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चित्रित किया गया है, अंतराल प्रतिलेखन कारक के अस्थायी अभिव्यक्ति विनियमित और सेल समारोह से संबंधित है के बारे में हमारे ज्ञान में वहाँ रहते हैं.
हाल ही में, स्टेम सेल के क्षेत्र परिपक्व अंत: स्रावी कोशिकाओं के मार्कर व्यक्त कि कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए ड्राइव आइलेट विकास के दौरान अस्थायी प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के बारे में संचित ज्ञान कार्यरत है. HESC और प्रेरित pluripotent कोशिकाओं (iPSC) से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की उत्पत्ति पर्याप्त बनाया गया है और यद्यपि- एक तथाकथित "ब्लैक बॉक्स 2 द्वारा पीछा अग्नाशय के अग्रदूत प्रतिलेखन कारक,) प्रत्यारोपण के बाद में विवो परिपक्वता व्यक्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 1) एक प्रारंभिक इन विट्रो भेदभाव: पिछले कुछ वर्षों में उल्लेखनीय प्रगति की है, सबसे प्रभावी प्रोटोकॉल दो अलग भेदभाव चरणों की आवश्यकता "अवधि. आगे बढ़ने के लिए, चाहे सेल स्रोत के बावजूद, एक जैव रासायनिक स्तर पर समझा जाना चाहिए, vivo में जीव विज्ञान अंतर्निहित आइलेट परिपक्वता को समझने में अग्रिम. ICC देखने और hESC साथ प्राप्त परिणामों के बीच समानता विट्रो में परिपक्व, ग्लूकोज उत्तरदायी, इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं में मानव अग्नाशय के अग्रदूत साबित कोशिकाओं के संक्रमण को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के एक नंबर अनजान रहते हैं कि पता चलता है. इस समझ के एक केंद्रीय हिस्सा अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं से कार्यात्मक अंत: स्रावी सेल आबादी प्राप्त करने के लिए उपन्यास तरीके विकसित करने के लिए किया जाएगा और hESC जैव रासायनिक appr न केवल आवश्यकता होगीपरिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए परिपक्वता की घटनाओं, लेकिन तरीकों को स्पष्ट है कि oaches.
क्यों हम मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं इमेजिंग आइलेट परिपक्वता में परिवर्तन की पहचान का एक महत्वपूर्ण पहलू है कि विश्वास करते हो? जवाब इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए ऐतिहासिक खोज में आंशिक रूप से निहित है. अग्नाशय के व्यापारियों और islets के लिए मॉडल और ऊतक संस्कृति सिस्टम दोनों शोधकर्ताओं ने इन विट्रो में पशु टापू और मानव islets की परिपक्वता के बीच विद्यमान महत्वपूर्ण मतभेदों का पता लगाने के लिए अनुमति दी है. मानव भ्रूण अग्न्याशय विकास का अन्वेषण करने के लिए एक सीमा है कि कानूनी तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि गर्भावधि उम्र केवल विषम सेल समुच्चय को जन्म दे रहा है. पृथक भ्रूण मानव कोशिकाओं टापू, धुंधला गर्भावधि उम्र 9-23 हफ्तों से इन विट्रो संस्कृति के बाद कम से कम 15% सबसे कोशिकाओं आइलेट हार्मोन के लिए धुंधला हो जाना नहीं के साथ, अंत: स्रावी कोशिकाओं के लिए मार्कर होते हैं पता चलता है जैसे लगते हैं. हालांकि, प्रत्यारोपण के बाद और मेंपरिपक्वता vivo, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या को अंत: स्रावी मार्करों 6,25 व्यक्त करते हैं. इन अध्ययनों से परिणाम में इन विट्रो भेदभाव के बाद हार्मोन सकारात्मक कोशिकाओं की आबादी बढ़ाने के लिए. इन विट्रो विधियों की संभावना में विवो आइलेट में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा केवल एक हार्मोन सकारात्मक अंत: स्रावी कोशिकाओं की मामूली आबादी उत्पन्न करने में सक्षम हैं कि hESC भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ आज प्रतिध्वनित किया जा रहा है परिपक्वता. इसके अलावा, मानव भ्रूण अग्नाशय के विकास ड्राइव कि आणविक घटनाओं को समझने की संभावना hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं निकाले जाते हैं और आगे β सेल पुनर्जनन और अग्नाशय सेल transdifferentiation कि विनियमित तंत्र को चित्रित करने के प्रयासों में सुधार होगा.
मानव भ्रूण अग्नाशय सेल और hESC परिपक्वता के बीच समानता सेल समारोह के लिए बढ़ाया जा सकता है. Murine कोशिकाओं की तरह, मानव भ्रूण कोशिकाओं और विभेदित hESC दोनों ग्लूकोज के जवाब में इंसुलिन रिलीज करने में असमर्थ हैंइन विट्रो 26,27 में आइलेट neoformation के बाद. हालांकि, नग्न चूहों और परिपक्वता, दोनों मानव आइलेट की तरह समूहों और hESC प्रदर्शनी एक endocrine फेनोटाइप से व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में प्रत्यारोपण पर. तीन महीने ग्राफ्टिंग के बाद, आबादी या तो से प्रतिरोपित कोशिकाओं का लगभग 90% इंसुलिन सकारात्मक रहे हैं, और सी पेप्टाइड 17,26 की रिहाई के द्वारा निर्धारित रूप में सामान्य रूप से कार्य करते हैं. इन परिणामों प्रत्यारोपण आइलेट परिपक्वता को बढ़ावा देने कि संदर्भ और अज्ञात cues प्रदान करता है कि संकेत मिलता है. ऐसे मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं परिपक्वता मिलाना और तेजी लाने के कारकों की पहचान करने के लिए खोज में सहायता करेगा के लिए, यहाँ वर्णित एक के रूप में अनुकूलित इमेजिंग प्रोटोकॉल,. विकास के इस स्तर पर एक अंत: स्रावी वंश के प्रति भेदभाव मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं और hESC के मौलिक जैव रासायनिक अन्वेषण परिपक्वता की दक्षता मापने के लिए आवश्यक है.
Figur में उल्लिखित निम्नलिखित प्रोटोकॉल,ई 1, इन कोशिकाओं के पूरे मानव भ्रूण अग्न्याशय और इमेजिंग से ICC देखने बुलाया मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं के अलगाव के लिए हमारे वर्तमान तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल बाद में एक monolayer के रूप में या निलंबन में उगाया जा सकता है जो ऊतकों से कोशिकाओं का एक प्रारंभिक तैयारी की आवश्यकता है. अंत: स्रावी सेल प्रसार और परिपक्वता का आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों की इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी में वर्णित है.
रासायनिक संशोधित एजेंटों की एक किस्म की अनुपस्थिति या उपस्थिति में जनरेशन और ICC देखने के इमेजिंग संस्कृति की स्थिति और पूरी तरह कार्यात्मक बहि, वाहिनीपरक, या में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं की परिपक्वता में तेजी लाने कि यौगिकों की पहचान में मदद करने के प्रत्यारोपण के मॉडल के साथ तुलना में एक तेजी से विधि प्रदान करता है हार्मोन अग्नाशय कोशिकाओं का निर्माण किया.
Protocol
आरंभ करने से पहले नोट:
- मानव भ्रूण pancreata जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला, ऊतक काटा जो वाशिंगटन विश्वविद्यालय (सिएटल, वाशिंगटन, संयुक्त राज्य अमरीका) से प्राप्त किया गया. नमूने के ऊतक दान, भंडारण, और उपयोग के लिए सूचित सहमति केंद्र द्वारा दानदाताओं से प्राप्त हुई थी. प्रोटोकॉल सहमति बयान लिखित में प्रदान की है और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो मानव अनुसंधान सुरक्षा कार्यक्रम पूरे अध्ययन (प्रोटोकॉल # 081237XT) को मंजूरी दी थी.
- यह मानव भ्रूण अग्न्याशय और पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर अग्न्याशय पकड़े कंटेनर दोनों बनाए रखने के लिए आवश्यक है. हदबंदी और पाचन जितनी तेजी से किया जाना चाहिए.
- मानव भ्रूण अग्न्याशय भंडारण और अग्न्याशय के परिवहन के लिए बफर से प्राप्त हुई थी जहां क्लिनिक भेजें. (RPMI-1640 + 10% सामान्य मानव सीरम (एनएचएस), 300 मिमी trehalose एसजी, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और fungizone).
मानव भ्रूण अग्न्याशय के 1. विच्छेदन
- 2.5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए HBSS में आर टी collagenase इलेवन की 5 मिलीग्राम भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ (autoclaved) जगमगाहट शीशी और दुकान में एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ समाधान बाँझ फ़िल्टर एक टिशू कल्चर हुड में, 2 बाँझ पेट्री डिश, एक बाँझ छोटे क्रूसिबल (एक क्रूसिबल उपलब्ध नहीं है, एक छोटे से बीकर प्रतिस्थापित किया जा सकता है), निष्फल कैंची, और संदंश निकल पड़े. अग्न्याशय धोने के लिए एक पेट्री डिश के लिए 2 मिलीलीटर HBSS जोड़ें. लगभग 1 मिलीलीटर छोड़ने भ्रूण अग्न्याशय, जिसमें ट्यूब से महाप्राण तरल.
- HBSS के बिना 60 मिमी पेट्री डिश में संदंश के साथ अग्न्याशय निकालें. इन प्रयोगों के लिए, भ्रूण ICC देखने 9 से 23 सप्ताह से लेकर गर्भावधि उम्र के साथ नए सिरे से pancreata से उत्पन्न कर रहे हैं. पहले gestionational उम्र में pancreata से अलगाव के कारण अग्न्याशय का आकार करने के लिए मुश्किल है. प्रोटोकॉल 23 सप्ताह, पी का हालांकि अधिग्रहण परे गर्भावधि उम्र की संभावना लागू हैancreata इस समय के बाद क्योंकि संघीय (अमेरिका) प्रतिबंध के लिए मुश्किल है. कभी कभी, भ्रूण अग्न्याशय प्लीहा, वसा, या मूल विच्छेदन से जुड़ी संयोजी ऊतक के साथ आता है. अतिरिक्त ऊतक नंगी आंखों से आसानी से दिखाई दे रहा है और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले अग्न्याशय से हटा दिया जाना चाहिए.
- पेट्री डिश में ठंड HBSS (~ 0.5 मिलीलीटर) की एक न्यूनतम मात्रा में अग्न्याशय कुल्ला.
- एक बर्फ बाल्टी में बाँझ संदंश और जगह का उपयोग कर छोटे बाँझ क्रूसिबल को साफ अग्न्याशय ले जाएँ. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक धारक में क्रूसिबल प्लेस और, कैंची की 2 जोड़े का उपयोग, सख्ती कई मिनट के लिए अग्न्याशय टुकड़ा. (आमतौर पर 2-5 मिनट, लेकिन समय ऊतक के आकार और दृढ़ता पर निर्भर करता है). तकनीक काटना जरूरी है. केवल विपरीत संभालती घूम रहा एक निश्चित स्थिति में कैंची का एक पक्ष पकड़ो. कैंची के सुझावों क्रूसिबल के तल पर आराम करना चाहिए. छोटे में अग्न्याशय को तोड़ने के लिए तेजी से कैंची गति के साथ जारीटुकड़े. ऊतक के टुकड़े छोटे, बेहतर collagenase काम करेंगे.
- अप करने के लिए 10 मिनट के लिए 200 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान प्रकार के बरतन सेट में collagenase और जगह युक्त शीशी HBSS + ऊपर कटा हुआ अग्न्याशय के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. पहले 5 मिनट के दौरान अधिक बार एक बार से जांच न करें. पाचन समय ऊतक गुणवत्ता पर निर्भर करता है, के रूप में छोटे रूप में 6 मिनट पर्याप्त हो सकता है. कणों से छोटे और एक समान हैं जब अंत बिंदु है.
- Collagenase गतिविधि को रोकने के लिए ठंड HBSS के साथ शीशी (10-15 मिलीग्राम) भरें. बर्फ पर रखें और गुच्छों के 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. अक्सर इस बिंदु पर, कुछ कोशिका मृत्यु हुई है और डीएनए मीडिया में जारी की है. यह मीडिया 'रेशेदार' बना सकते हैं; इस मामले में, समाधान के लिए 100 μl DNase (10 मिलीग्राम / एमएल शेयर) जोड़ें.
- जगमगाहट शीशी में ऊतक (7-8 मिलीलीटर) से थोड़ा कम से कम आधा भरा इसे छोड़ने शीर्ष स्तर से 10 मिनट, महाप्राण के लिए बस गया है के बाद. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, 5 एमएल HBSS जोड़ें. 300 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- HBSS Aspirate और RPMI 1640, Glutamax, 10% सामान्य मानव सीरम (एनएचएस), 10 मिमी HEPES पीएच 7.2, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और fungizone युक्त 5 एमएल मीडिया में कोशिकाओं resuspend. 60 मिमी पेट्री डिश पर थाली. Β कोशिकाओं को उत्पन्न करने की कोशिश कर रहे शोधकर्ताओं के लिए, मीडिया के लिए HGF (10 एनजी / अंतिम मिलीलीटर) जोड़ें. इसके अतिरिक्त, समूहों की एक संख्या Incretin हार्मोन जीएलपी -1 के साथ संस्कृति मीडिया का सप्लीमेंट भी β कोशिकाओं 28 कि बढ़ता दिखा दिया है. प्रकोष्ठों ICC देखने समग्र और फार्म करने के लिए 72 घंटे के लिए निलंबन में छोड़ दिया जाना चाहिए.
- निलंबन के 72 घंटे बाद, कोशिकाओं पहले 29 में वर्णित के रूप में मानव कोशिका लाइन HTB9 मैट्रिक्स की मैट्रिक्स पर चढ़ाया जा सकता है. भले ही विकास की स्थिति का, मीडिया हर 48 घंटा परिवर्तित किया जाना चाहिए.
निलंबन में हो ICC देखने में Endocrine सेल प्रसार और परिपक्वता के मार्कर के 2. Immunofluorescence, monolayer, या कांच coverslips पर
- सेल प्रसार को मापने के लिए, निलंबन में पक्षपाती कोशिकाओं या कोशिकाओं या तो BrdU लेबलिंग पूर्व पीएफए निर्धारण करने के लिए 12 घंटे के लिए किया जाता है. BrdU अभिकर्मक पतला है 1:100 और RPMI 1640 में निष्फल फिल्टर, Glutamax, 10% एनएचएस, 10 मिमी HEPES पीएच 7.0, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और fungizone.
- निलंबन में कोशिकाओं के लिए: 300 XG और महाप्राण संस्कृति के माध्यम से कम 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. 300 XG और महाप्राण पर 5 मिनट के लिए, अपकेंद्रित्र ICC देखने को धोने के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें. ICC देखने आयल में एम्बेड करने के लिए जा रहे हैं, वैकल्पिक प्रोटोकॉल 3.1-3.17 का पालन करें पक्षपाती कोशिकाओं के लिए:. संस्कृति के माध्यम से निकालें और ऊपर वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. फिर पीबीएस के साथ दो बार धोने, आरटी पर 4% पीएफए के साथ 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें. इस बिंदु पर, प्लेटें Parafilm के साथ लपेटा जा सकता है और अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत.
- आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन-X 100 के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और अवरुद्ध बफर लागू (2% करn कुंजी सीरम, 2% गोजातीय सीरम albumin, 1 घंटे के लिए पीबीएस) में पतला 50 मिमी ग्लाइसिन. (बफर पतला 1:10 अवरुद्ध) कार्य बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें. काम कर बफर में एंटीबॉडी पतला. कांच coverslips पर विकसित कोशिकाओं के लिए, 60 μl कुल मात्रा में एंटीबॉडी पतला. 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं के लिए, 600 μl कुल मात्रा में एंटीबॉडी पतला. कई epitopes दाग, एंटीबॉडी के एक कॉकटेल लागू किया जा सकता है. एक नियंत्रण के रूप में, आईजीजी उपयोग या विशिष्ट एंटीबॉडी के स्थान पर प्रतिरक्षा सीरम पूर्व. प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में नियंत्रण के नमूने एक ही प्रजाति से नियंत्रण आईजीजी साथ incubated किया जाना चाहिए.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या ओ / एन में 1.5 घंटा या तो प्राथमिक एंटीबॉडी सेते प्राथमिक एंटीबॉडी Aspirate और आरटी पर कार्य बफर के साथ 3x धो लो.
- एलेक्सा संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए 1:1,000 - Rhodamine और FITC संयुग्मित एंटीबॉडी, 1:500 के लिए 1:200 पर माध्यमिक एंटीबॉडी पतला. यह सभी माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. नमूनों को कवरसंकेत के नुकसान को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में. आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
वैकल्पिक: नाभिक कल्पना, DAPI माध्यमिक ऊष्मायन के दौरान 1:500 में जोड़ा जा सकता है. इस कुल सेल की आबादी में प्रोटीन अभिव्यक्ति की quantitation के लिए उपयोगी है. - माध्यमिक एंटीबॉडी Aspirate और आरटी पर कार्य बफर के साथ 3x धो लो. बफर में डूबे जबकि एक coverslip पर विकसित कोशिकाओं के लिए, धीरे संदंश के साथ coverslip उठा; पीबीएस में डुबो कर इसे धो लो. 6 अच्छी तरह से थाली में विकसित कोशिकाओं के लिए, पीबीएस धोने और महाप्राण को जोड़ें. इस बिंदु पर वे एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत जांच के लिए तैयार हैं.
- अतिरिक्त पीबीएस से छुटकारा पाने के लिए एक Kimwipe पर धीरे coverslip के किनारे को स्पर्श करें. एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते जेल की एक बूंद जोड़ें और स्लाइड पर coverslip पलटना. आकांक्षा से अतिरिक्त बढ़ते जेल निकालें. बुलबुले को दूर करने के लिए एक 200 μl pipet टिप के पीछे के साथ धीरे coverslip टैप करें.
- 4 डिग्री सेल्सियस के बारे में 20 मिनट या ओ / एन के लिए कमरे के तापमान पर और एक लचीला तहत जांच सूखीuorescent या confocal खुर्दबीन.
आयल एम्बेडेड ICC देखने से प्रोटीन की 3. (वैकल्पिक) immunofluorescent धुंधला
- एक 3% agarose समाधान तैयार करें और शांत करने के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस जाने
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1500 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को निलंबन में incubated ICC देखने, और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण.
- कोशिकाओं से मीडिया aspirate और आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 μl 4% पीएफए के साथ तय कर लो. गोली बहुत बड़ा है, जब तक गोली मत मिलाओ.
- 750 μl पीबीएस के साथ दो बार गोली धो लें. 4% पीएफए की तरह, इस कचरे को खतरनाक माना जाता है और अपनी संस्था के खतरनाक कचरे विनिर्देशों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए.
- धीरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की दीवार के नीचे agarose के 150-200 μl ढीला और जोड़ने के लिए सेल गोली झटका.
- धीरे ट्यूब flicking द्वारा मिक्स, लेकिन बुलबुले फार्म नहीं है.
- 5-10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दृढ़ करने की अनुमति दें.
- बेदखल करने के लिए एक 21 जी सुई का प्रयोग करेंएक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में गोली और जगह.
- स्लाइड पर आयल embedding और वर्गों की तैयारी एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर साइट पर या अपने मूल माइक्रोस्कोपी सुविधाओं से किया जा सकता है.
- ऊतक, हाइड्रेट Deparaffinize, और जल्दी से पानी से धो लें.
- शेष एल्डिहाइड बुझाने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.2 एम ग्लाइसिन जोड़ें.
- 2 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड धो लें.
- प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, गर्म थाली पर फोड़ा करने के लिए 10 मिमी साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) लाने. इसे वापस एक उबाल आने के लिए इंतजार, और 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा, बफर में विसर्जित स्लाइड.
- Hotplate से बीकर निकालें. बफर में शांत करने के लिए स्लाइड के लिए लगभग 40 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- , 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 एच ओ के साथ दो बार स्लाइड्स धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड्स धो, 1 घंटे के लिए पीबीएस में 2% सामान्य गधा सीरम के साथ ब्लॉक.
- 0.2% ट्राइटन X-100 युक्त कार्य बफर में सही एकाग्रता को पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.आम तौर पर, प्राथमिक एंटीबॉडी रातोंरात incubated है प्रतिलेखन कारक के लिए और 1.5 घंटे के लिए धुंधला यदि हार्मोन, प्रसार के मार्कर, और / या भेदभाव के लिए धुंधला हो जाना.
- ऊपर वर्णित चरणों 2.3-2.9 का पालन करें.
Representative Results
भ्रूण ICC देखने की सावधान तैयारी इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं को आमतौर पर चढ़ाना के बाद परिभाषित अवधि पर देखने के लिए कैसे की प्रतिनिधि तस्वीर चित्रा 2 में दिखाया गया. शुद्धि के बाद, हौसले चढ़ाया सेल समुच्चय कुछ कोशिकाओं (चित्रा 2A) होते हैं कि के रूप में छोटे, विरल स्पष्ट समूहों दिखाई देते हैं. पहले 24 घंटे (चित्रा 2 बी) के बाद, सेल समूहों के कई बड़े हो जाते हैं, लेकिन कई छोटे समूहों में रहते हैं. 48 घंटा करके, समूहों में काफी विस्तार किया है, लेकिन (चित्रा -2) विषम रहना है. 72 घंटा में, ICC देखने, आकार और आकृति (चित्रा 2 डी) में अपेक्षाकृत वर्दी स्पष्ट किया जाना चाहिए. यह कोशिकाओं को या तो ऐसे HTB-9, 24 घंटा पूर्व immunofluorescence करने या जीनों की अभिव्यक्ति को बदल सकता है अभाव या रसायनों या दवाओं की उपस्थिति में एक और 72 घंटे के लिए बढ़ने की अनुमति दी के लिए के रूप में, matrices पर चढ़ाया जा सकता है कि इस बिंदु पर है अग्नाशय के अंत: स्रावी सेल जी के लिए आवश्यकeneration. 3 पर प्रकाश डाला गया अग्नाशय अन्तर्जनस्तर की दिशा में आईसीसी प्रसार या भेदभाव या तो मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के एक नंबर चित्रा. चित्रा 3 में, ICC देखने, HTB-9 पर चढ़ाया गया 4 दिनों के लिए हो, और PDX1, अग्नाशय के विकास का एक महत्वपूर्ण मार्कर के लिए दाग. ICC देखने के लिए इन विट्रो धुंधला हमारी प्रयोगशाला में नियमित तौर पर किया जाता है, अधिक बार, मानव भ्रूण ICC देखने नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रतिरोपित और पैदा करना और इन विवो 6,9,30-32 में अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है. प्रत्यारोपण के बाद निर्दिष्ट समय पर, चूहों बलिदान कर रहे हैं और प्रत्यारोपित ICC देखने युक्त गुर्दा निकाल दिया जाता है, 4% paraformaldehyde में तय हो, और आयल में एम्बेडेड. अनुक्रमिक 5 माइक्रोन वर्गों एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर साइट पर या एक कोर माइक्रोस्कोपी सुविधा द्वारा या तो उत्पन्न कर रहे हैं. मिलान unmasking और Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी के लिए आयल एम्बेडेड ऊतक से प्रोटीन का धुंधला वैकल्पिक प्रोटोकॉल 3.10-3 में वर्णन किया गया है.. सेल प्रसार का आकलन करने के लिए और Ki67 (लाल) के साथ, 17 चित्रा 3 बी में प्रतिरोपित ICC देखने उपकला सेल मार्कर पैन cytokeratin (हरा PanCK) के साथ दाग रहे थे. एक अन्य उदाहरण में, मानव इंसुलिन (हरा) और ग्लूकागन (लाल) दोनों एक नग्न माउस (चित्रा -3 सी) के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण और परिपक्वता के बाद पता चला रहे थे.
चित्रा 1. Immunofluorescence के लिए मानव भ्रूण आईसीसी तैयारी और धुंधला के चार्ट प्रवाह.
चित्रा 2. 0 पर प्रतिनिधि भ्रूण ICC देखने तैयारी, चढ़ाना के बाद 24, 48, या 72 घंटे. (ए) ICC देखनेनिलंबन में तुरंत चढ़ाना के बाद imaged थे, चढ़ाना, या (घ) चढ़ाना के बाद 72 घंटे के बाद (बी) 24 घंटा चढ़ाना के बाद, (सी) 48 घंटा. एसी के लिए स्केल बार, 10x बढ़ाई = 300 माइक्रोन, विकास के लिए पैमाने पर पट्टी, = 100 माइक्रोन 20 बढ़ाई. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
.. (; हरी अखिल सीके) और प्रसार (Ki67, लाल), (सी) इंसुलिन मढ़वाया ICC देखने के चित्रा 3 Immunofluorescence नियमित, ICC देखने (ए) अग्नाशय अन्तर्जनस्तर मार्कर PDX1 (हरा), (ख) अंत: स्रावी कोशिकाओं के लिए imaged हैं (हरा) और ग्लूकागन (लाल). एसी के लिए स्केल बार, 40x बढ़ाई = 20 माइक्रोन.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत तरीकों सेल प्रसार और अग्नाशय अन्तर्जनस्तर के मार्कर के लिए मानव भ्रूण अग्न्याशय और बाद में छवि से ICC देखने उत्पन्न करने के लिए एक सक्षम. मानव भ्रूण अग्न्याशय हदबंदी की प्रक्रिया एक 72 घंटा आईसीसी गठन अवधि, माउस से β सेल पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल से काफी अलग है कि एक दृष्टिकोण के द्वारा पीछा किया, के बारे में 90 मिनट की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल शोधकर्ता मानव भ्रूण अग्नाशय के विकास का पता लगाने के लिए अनुमति देता है एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका प्रदान करता है. अनुदैर्ध्य अध्ययन के दो विभिन्न प्रकार किया जा सकता है. सबसे पहले, अलग गर्भावधि उम्र से कार्यात्मक अग्नाशय प्रकार की कोशिकाओं (वाहिनीपरक कोशिकाओं, बहि कोशिकाओं, और हार्मोन सकारात्मक कोशिकाओं) उत्पन्न करने की क्षमता प्रत्यारोपण के बाद मूल्यांकन किया जा सकता. दूसरा, एक एकल गर्भावधि उम्र से ICC देखने, संस्कृति में विकसित चयनित औषधीय एजेंटों के साथ इलाज किया और मतभेदों का पता लगाने के लिए आईसीसी संस्कृति के दौरान अलग अलग समय बिंदुओं पर प्रत्यारोपित किया जा सकता हैसेल भाग्य में. वर्तमान में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में hESC भेदभाव के निर्देश पर किया जा रहा है जबरदस्त प्रयासों के साथ, शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में इंसुलिन स्राव से संबंधित समस्याओं को फिर से पुनर्जीवित किया जा रहा है. मानव ICC देखने भ्रूण अग्न्याशय सेल प्रसार और β सेल के विकास के इस महत्वपूर्ण पहलू का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.
ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, विवरण सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. मानकों के एक नंबर प्रयोग का प्रदर्शन प्रयोगशाला कर्मियों के नियंत्रण से बाहर दुर्भाग्य से कर रहे हैं. इस प्रयोगशाला द्वारा सामना करना पड़ा दो समस्याओं गरीब प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता और गैर अग्नाशय के ऊतकों का वितरण शामिल है. स्वस्थ भ्रूण अग्नाशय के ऊतकों एक कैंची काटने के लिए फर्म है. ऊतक में कटौती भी आसानी से करते हैं, तो यह अग्नाशय एंजाइमों अग्न्याशय खुद को पचाने के लिए शुरू कर दिया है कि एक संकेत है. इस से वहाँ कोई वसूली दुर्भाग्य है और तैयारी सर्वश्रेष्ठ रद्द कर दिया है. कभी कभी, एक मेंअग्न्याशय हटाने अनुभवी तकनीशियन अग्न्याशय के लिए पेट के वर्गों को भ्रमित करेंगे. इन नमूनों को एक अग्न्याशय की तुलना में काफी अधिक लोच है और एक उल्लेखनीय लुमेन उपस्थित रहेंगे. फिर, इन नमूनों खारिज किया जाना चाहिए.
के रूप में वर्णित ऊपर प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, तो ट्रैक से अलगाव फेंक करने के लिए उठता है कि किसी भी मुद्दे को शायद ही कभी रहे हैं. एक चिकनी अलगाव सुनिश्चित करने के लिए याद करने के लिए कुछ बिंदुओं सटीक अग्न्याशय काटने के लिए तेज कैंची का उपयोग करने के लिए और पचाने के लिए बहुत बड़ी किसी भी ऊतक का नमूना नहीं छोड़ कर सुनिश्चित करना शामिल है. कटौती काफी छोटा नहीं कर रहे हैं, तो collagenase प्रभावी ढंग से काम नहीं करता है, और कुछ ICC देखने का गठन कर रहे हैं. Collagenase के एक नए बैच का उपयोग करते समय पाचन के लिए आइयू (अंतरराष्ट्रीय इकाइयों) पहले से इस्तेमाल के रूप में इसके विपरीत, यदि एक समान स्तर के साथ शुरू करते हैं. हालांकि, पर पाचन उत्पन्न नहीं होती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ऊष्मायन समय कम. यह समस्या निवारण तकनीक आइयू लेबल बैच से बीए करने के लिए काफी भिन्न नहीं है कि यह सुनिश्चित करता हैदर्पण.
परिप्रेक्ष्य में लिया, मानव भ्रूण ICC देखने के अलगाव के लिए इस तकनीक के क्षेत्र में अपेक्षाकृत मानक है. अधिकांश प्रयोगशालाओं मीडिया को HGF के अलावा कोशिकाओं 33 जीवित है और पैदा करना मदद करता है कि हमारे निष्कर्ष की पुष्टि की. संक्षेप में, हम 9 से 23 सप्ताह से लेकर गर्भावधि उम्र के साथ मानव भ्रूण ICC देखने ताजा pancreata अलग करने के लिए एक विधि विकसित की है. कोशिकाओं अग्नाशय के अंत: स्रावी प्रतिलेखन कारक और मानव इंसुलिन कल्पना करने के लिए एक monolayer या प्रयोगों के लिए निलंबन के रूप में विकसित किया जा सकता है.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम रिजनरेटिव मेडिसिन (RB3-02266) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट और एनआईएच (DK54441) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
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