A Single-fly Assay til fourageringsadfærd i<em> Drosophila</em
Summary
I denne video artikel beskriver vi en automatiseret analyse for at måle effekten af sult eller mæthed på olfaktoriske afhængig mad søgeadfærd i den voksne bananfluen Drosophila melanogaster.
Abstract
For mange dyr, sult fremmer ændringer i det olfaktoriske system på en måde, der letter søgningen efter egnede fødekilder. I denne video artikel beskriver vi en automatiseret analyse for at måle effekten af sult eller mæthed på olfaktoriske afhængig mad søgeadfærd i den voksne bananfluen Drosophila melanogaster. I en lystæt kasse belyst af rødt lys, der er usynligt for bananfluer, et kamera er knyttet til erhvervelse custom data software overvåger placeringen af seks fluer samtidig. Hver flue er begrænset til at gå i de enkelte arenaer, der indeholder en fødevare lugt i centrum. Afprøvningsplanerne arenaer hvile på et porøst gulv, der fungerer for at forhindre lugt akkumulering. Latency at lokalisere lugt kilde, en metrik, der afspejler lugtesans under forskellige fysiologiske tilstande, bestemmes ved hjælp af software-analyse. Her diskuterer vi de kritiske mekanik kører denne adfærdsmæssige paradigme og dække specifikke emner vedrørende flyve loading, lugt forurening assay temperatur, datakvalitet og statistiske analyser.
Introduction
Tilstande af sult fremmer to typer appetitive adfærd: Søg Mad og fødevareforbrug 1. Denne enkle adfærdsmæssige analyse er nyttig for studiet af kemotaktiske adfærd i forbindelse med fouragering 2,3. Konkret er det spor flue position, ganghastighed og latenstid til at lokalisere en fødevare lugt mål. Latenstid af fødevarer fund tjener som metrik til at måle ændringer i følsomheden af flue lugt detection system nedstrøms ændringer i sin interne appetitive tilstand. En manuel version af dette assay er tidligere blevet anvendt til at vise, GABA-B-receptor-signalering er vigtig for lugt lokalisering adfærd hos voksne fluer 3. Den aktuelle automatiserede version af analysen var medvirkende til studiet af, hvordan kort neuropeptid-F (sNPF) signalering omformer olfaktoriske kortet i Drosophila og påvirkninger appetitive adfærd 2..
Test er udført på et mørkt, temperatur og fugtighed kontrolleret rum. Digitalvideokameraer ovenfor anførte de klare akryl test plader spore fluer baggrundsbelyst med 660 nm LED belysning. Information fra kameraet behandles i realtid ved en computer stationeret ved siden af testområdet. Vi anvender datafangst software til at registrere og gemme koordinater flyve positioner under testperioden.
I dette paradigme, er emnet frigives i en arena, der indeholder en fødevare lugt i midten, den lugt objekt skaber en fødevare lugt gradient i arena, der inducerer mad søgeadfærd i fluen. En lignende lugt søgeprotokol er blevet anvendt mod studiet af chemosensation i single Drosophila larver 7. Mens andre adfærdsmæssige assays, såsom de fire felter olfaktometer 4,5 eller t-labyrint 6 vurdere lugt aversion eller tiltrækning adfærd, er dette paradigme bedst egnet til at vurdere lugtesans og kemotaksis adfærd.
Flere vigtige fordele ledsage denne ASSAy. For det første tillader hurtig tilegnelse af store datasæt, fordi indsamling og analyse af data for det meste er automatiseret. For det andet, denne analyse isolerer og måler adfærd enkelte fluer, og dermed fjerne de sociale olfaktoriske tidskoder, der kan påvirke deres adfærd. For det tredje, enkelhed af protokollen og enkle eksperimentelle design gør analysen effektiv og let at undervise andre.
Desuden kan dette assay anvendes til yderligere at undersøge neurale kredsløb underliggende fødevarer søgeadfærden ved at kombinere det med den omfattende genetiske værktøjskasse til rådighed for Drosophila melanogaster 8. Målrettet ekspression af transgener, der stilhed eller ophidse neuroner kan opnås med værktøjer såsom GAL4-UAS system samt UAS-shibire TS1, UAS-tetanus-toksin, og UAS-TRPA1 (B) transgener 9-12.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, vi skal beskrive en trin-for-trin procedure til fødevareindustrien søgeadfærd assay. Ud over fødevarer relaterede lugte, kan det også være tilpasset til studiet af fluen evne til at lokalisere andre lugt objekter. For eksempel kan det blive anvendt mod studiet af mate lokalisering adfærd i mandlige fluer 3 Der er flere andre overvejelser for denne protokol, som vi vil nævne her vedrørende denne procedure.:
Først temperaturen opdræt afgør, hvor længe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til JWW fra National Institute of Health (R01DK092640) og National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. . The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
