Optisk påvisning af<em> E. coli</em> bakterier ved Mesoporøse Silicon biosensorer
Summary
En etiket-fri optisk biosensor for hurtige bakterier detektion introduceres. Biosensoren er baseret på en nanostruktureret porøs Si, som er designet til direkte at fange målet bakterieceller på dens overflade. Vi anvender monoklonale antistoffer immobiliseret på den porøse transducer, som bindingsprober. Vore undersøgelser viser anvendeligheden af disse biosensorer til påvisning af lave bakterielle koncentrationer inden for få minutter uden forudgående forarbejdning prøve (såsom cellelysis).
Abstract
En etiket-fri optisk biosensor baseret på en nanostruktureret porøs Si er designet til hurtig opsamling og påvisning af Escherichia coli K12 bakterier, som en model mikroorganisme. Biosensoren afhængig direkte binding af target bakteriecellerne på dens overflade, mens ingen forbehandling (f.eks cellelysis), i den undersøgte prøve er påkrævet. Et mesoporøst Si tynd film anvendes som optiske transducer element i biosensoren. Under hvidt lys belysning, viser det porøse lag vel løst Fabry-Perot fringe mønstre i sin refleksionsevne spektrum. Anvendelse af en hurtig Fourier transformation (FFT) til reflektivitet data resulterer i en enkelt top. Ændringer i intensiteten af FFT peak overvåges. Således målbakterier fange på biosensoroverfladen gennem antistof-antigen interaktioner inducerer målbare ændringer i intensiteten af FFT toppe, giver mulighed for en "real time" observation af bakterier vedhæftet fil.
nt "> mesoporøse Si film, fremstillet ved en elektrokemisk anodiseringsproces, konjugeres med monoklonale antistoffer, der er specifikke for den pågældende bakterie. immobilisering, immunaktivitet og specificitet af antistofferne bekræftes ved fluorescerende mærkning eksperimenter. Når biosensoren er udsat for målbakterier cellerne direkte fanget på antistof-modificerede porøs Si overflade. Disse specifikke opfange begivenheder medfører intensitet ændringer i optisk interferens spektret er tynd film af biosensoren. Vi viser, at disse biosensorer kan påvise relativt lave bakteriekoncentrationer (afsløring grænse på 10 4 celler / ml) i mindre end en time.Introduction
Tidlig og præcis identifikation af sygdomsfremkaldende bakterier er yderst vigtig for fødevare-og vandsikkerhed, miljøovervågning, og point-of-care diagnostik 1. Som traditionel mikrobiologi teknikker er tidskrævende, besværligt, og mangler evnen til at detektere mikroorganismer i "real-time" eller uden for laboratoriet miljø, er biosensorer udvikler sig til at imødekomme disse udfordringer 2-5.
I de senere år har porøs Si (PSI) dukket op som et lovende platform for udformningen af sensorer og biosensorer 6-20. Gennem det seneste årti talrige undersøgelser vedrørende PSI-baserede optiske sensorer og biosensorer blev offentliggjort 21,22. Den nanostrukturerede PSi lag fremstilles typisk ved elektrokemisk anodisk ætsning fra en enkelt krystal Si wafer. De resulterende Psi nanomaterialer udviser mange fordelagtige egenskaber, såsom stor overflade og fri volumen, pore størrelser, der kan kontrolleres og tunable optical egenskaber 10,16. De optiske egenskaber af Psi lag, såsom fotoluminescens 8,11 og hvidt lys reflektans-baserede interferometry 7,19, er stærkt påvirket af miljømæssige forhold. Opsamling af gæstemolekyler / målanalytter i de porøse lag resulterer i en ændring i det gennemsnitlige brydningsindeks af filmen, observeres som en graduering i fotoluminescens spektrum eller som en bølgelængdeforskydning i reflektionsniveauet spektrum 10.
Selv om langt innovation i PSi optisk biosensor teknologi, der er kun få rapporter om PSI-baserede platforme for bakterier afsløring 6,8,20,23-29. Desuden har de fleste af disse proof-of-concept studier har vist "indirekte" bakterier afsløring. Således er normalt, før lysis af celler kræves for at udtrække de målrettede protein / DNA-fragmenter, som er karakteristiske for de undersøgte bakterier 29. Vores tilgang er at direkte fange målbakterierneceller på PSI biosensor. Derfor er monoklonale antistoffer, som er specifikke til at målrette bakterier, immobiliseres på den porøse overflade. Binding af bakterieceller, via antistof-antigen-interaktioner på overfladen af biosensoren inducere ændringer i amplituden (intensiteten) af refleksionsevne spektrum 24-26.
I dette arbejde, rapporterer vi om opførelsen af en optisk PSi-baserede biosensor og demonstrere dens anvendelse som en etiket-fri biosensorer platform til påvisning af Escherichia coli (E. coli) K12 bakterier (bruges som model mikroorganisme). Den overvågede optiske signal er reflekteret fra PSi nanostruktur grund Fabry-Perot tynd film interferens (figur 1A) lys. Ændringer i lyset amplitude / intensitet korreleret til specifik immobilisering af target bakteriecellerne på biosensoroverfladen, giver mulighed for hurtig påvisning og kvantificering af bakterierne.
Protocol
Representative Results
Discussion
En etiket-fri optisk immunosensor, baseret på en PSiO 2 nanostruktur (en Fabry-Perot tynd film) er fremstillet, og dets potentielle anvendelighed som en biosensor for bakterier detektion er bekræftet.
Ændringer og fejlfinding
Et af de største problemer, når designe en immunosensor er modtageligheden af antistoffer til at undergå uønskede kropsbygning ændringer under afsætning og mønster på det faste substrat, hvilket kan føre til et fald i bio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (tilskud nr. 1118-1108 og tilskud nr. 1146/12) og Minna Kroll Memorial Research Fund. ES taknemmelig økonomisk støtte fra Russell Berrie Nanoteknologi Institut.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
References
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
